一種花生籽仁的石蠟切片方法技術

本發明專利技術提供一種花生籽仁的石蠟切片方法，其包括以下步驟：1）取材；2）5%~10%戊二醛固定；3）脫水：80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度重復1次；4）透明：體積比1:1二甲苯：100%乙醇20~30min，二甲苯15~25min，二甲苯15~25min；5）直接透蠟法透蠟，包埋，切片；6）脫蠟，復水，蘇木素-曙紅復染，脫水，透明，封片。本發明專利技術能較好的固定花生籽仁細胞組織，切片完整、連續、不存在空洞，切片厚度可達7?m，且操作簡單，適用于所有花生品種，便于推廣應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及石蠟切片
，具體地說，是。
技術介紹
花生籽仁是花生收獲的主要目標產物，決定著花生產量和品質的形成，但花生籽仁在生長過程中容易受到黃曲霉等病菌的侵染。研究表明，花生種皮的低滲透性、強韌性及耐破損等特征使花生對病害、蟲害具被動抵制作用，因此花生種皮的完整性、強度對花生抗黃曲霉侵染等具有重要的屏障作用。花生種皮結構是評價花生種質抗、感黃曲霉侵染能力的重要指標，普通顯微觀察表明抗病品種的種皮結構存在較大差異，抗病品種的種皮細胞壁較厚，表皮細胞間結合緊密，柵欄細胞層嚴密厚實，裂縫和氣孔較少；感病品種的種皮細胞壁則相對較薄，細胞間結合較疏松，裂縫和氣孔較大，種皮具有較厚蠟質層。但是由于花生籽仁油分和蛋白質含量高，制作普通切片時，存在粘刀、薄厚不均、不連續或不完整等問題，很難得到理想的切片。石蠟切片法由于操作簡單、價格低廉、可連續制片等特點，一直是觀察細胞組織的形態結構及其動態變化的理想生物學研究技術。石蠟切片制作過程包括固定、脫水、透明、 透蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、染色、透明以及封片等步驟，在生物學的許多領域都得到了廣泛的應用。但是由于花生籽仁油分和蛋白質含量非常高，其石蠟切片的效果一直不盡人意。 因此為便于觀察花生細胞組織結構及動態變化，深入分析黃曲霉侵染花生的細胞學機理，明確抗、感黃曲霉花生種質的細胞學差異，篩選抗黃曲霉花生種質用于生產實踐， 亟需一種可獲得理想切片的花生籽仁的石蠟切片方法，但是目前關于這類該切片方法尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中的不足，提供。為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案是，包括以下步驟I)取材；2)固定采用體積濃度為5°/Γ Ο%戊二醛固定；3)脫水80%乙醇50min,95%乙醇45min, 100%乙醇45min,每梯度至少2次脫水過程；4)透明體積比1:1 二甲苯100%乙醇處理20 30min，二甲苯處理15 25min，二甲苯處理15 25min ；5)透蠟、包埋和切片采用熔點為54 56°C的切片石蠟的直接透蠟2次，每次 1.5 2h，透蠟后包埋，切片；6)脫臘、染色和封片脫蠟二甲苯3(T40min，重復I次；復水100%乙醇2 3min,重復I次；95%乙醇2 3min,重復I次；80%乙醇2 3min, 重復I次；50%乙醇2 3min ;蒸懼水2 3min ；復染蘇木素染液6 8min,蒸懼水沖洗5 7min,曙紅染液染色3minl5s 4min ；脫水95%乙醇2 3min，重復I次，100%乙醇2 3min，重復I次；透明二甲苯2 3min，重復3次；封片。優選的，所述的花生籽仁的石蠟切片方法包括以下步驟I)取材；2)固定采用體積濃度為5%戊二醛固定；3)脫水80%乙醇50min,95%乙醇45min, 100%乙醇45min,每梯度至少2次脫水過程；4)透明體積比1:1 二甲苯100%乙醇處理20min, 二甲苯處理15min, 二甲苯處理 15min ；5)透蠟、包埋和切片采用熔點為54 56°C的切片石蠟直接透蠟2次，每次I. 5h， 透蠟后包埋，切片；6)脫蠟、染色和封片脫蠟二甲苯30min，重復I次；復水100%乙醇2min,重復I次；95%乙醇2min,重復I次；80%乙醇2min,重復I 次；50%乙醇2min ;蒸懼水2min ；復染蘇木素染液6min,蒸懼水沖洗5min,曙紅染液染色3minl5s ；脫水95%乙醇2min，重復I次，100%乙醇2min，重復I次；透明二甲苯2min，重復3次；封片。所述的蘇木素染液為每升蒸餾水中含有蘇木素lg、碘酸鈉O. 2g、鉀明礬90g、檸檬酸lg、水合氯醒50g。所述的曙紅染液由以下物質組成質量分數為1%的曙紅Y水溶液、95%乙醇和冰醋酸，其體積比依次為100:780:4。本專利技術的改進之處具體如下I、固定步驟常用的單一或混合固定劑如乙醇、甲醛、醋酸、FAA以及瓦納興等，對于花生籽仁樣品的的固定效果并不理想，在切片過程中常出現切片不連續、有空洞等現象。 本專利技術采用電鏡樣品固定常用的戊二醛，其體積濃度為59TlO%，取得了良好的固定效果，切片連續，破裂情況大大減少，易著色，且無空洞現象出現。為了保證固定效果，固定過程中可更換固定液3 4次，以保證戊二醛固定液的體積濃度穩定在59TlO%。2、脫水步驟花生種子由于蛋白質和脂肪含量高，脫水很難徹底，導致石蠟難以全面滲透。因此，本專利技術適當延長了脫水時間，具體是80%乙醇50min，95%乙醇45min，100% 乙醇45min，每步驟重復一次，可保證脫水效果。3、透明步驟蛋白質對水分有很強的親和力，而花生籽仁中蛋白質含量極其豐富， 導致脫水劑很難置換出來。為此，本專利技術采用了體積比1:1的二甲苯乙醇過度方法，具體透明過程如下11 二甲苯100%乙醇20 30min，二甲苯15 25min，二甲苯15 25min。44、透蠟步驟由于花生蛋白質含量高，為避免其吸漲作用，本專利技術采用了直接透蠟法。同時，由于花生籽仁中的蛋白質和脂肪對石蠟滲入的阻擋作用很強，本專利技術適當延長了透蠟時間，所用石蠟為熔點54 56°C的切片石蠟，達到了很好的效果，透蠟完全，切片完整。5、染色步驟由于戊二醛固定液會使切片染色淺，分色不明顯，因此，復水后的切片采用了蘇木素_曙紅復染，并適當延長了染色時間，結果表明，戊二醛固定液對染色沒有明顯的影響，切片染色效果良好，染色深度合適，分色明顯。總之，本專利技術具備以下優點I、本專利技術能較好的固定花生籽仁細胞組織，克服了普通顯微觀察中由于花生籽仁油分和蛋白質含量過高導致的切片粘刀、薄厚不均、不連續或不完整等缺點。2、本專利技術克服了花生籽仁石蠟切片過程中存在的切片不完整、不連續、存在空洞等技術問題，切片厚度可達7 μ m。3、本專利技術方法操作簡單，適用于所有花生品種，便于推廣應用。附圖說明附圖I是實施例I制作的抗黃曲霉侵染的Jll和感黃曲霉侵染的金花1012花生籽仁石蠟切片的顯微圖。附圖2是實施例I和對比例分別制作的抗黃曲霉侵染的Jll的花生籽仁石蠟切片顯微圖。具體實施方式下面結合附圖對本專利技術提供的具體實施方式作詳細說明。本文中，所述的乙醇溶液，其濃度均指體積濃度，如“80%乙醇”即體積分數為80% 的乙醇溶液。實施例II、取材取黃曲霉侵染后8d (天)的抗、感花生品種Jll和金花1012的花生籽仁， 分開兩片子葉，再橫切。2、固定采用電鏡樣品固定常用的戊二醛，戊二醛的體積濃度為5%，以雙蒸水作為溶劑，將花生籽仁切片放入固定劑中，固定過程中更換固定液3次。3、脫水樣品采用乙醇脫水，具體脫水程序為80%乙醇50min，95%乙醇45min， 100%乙醇45min，每梯度2次脫水過程，樣品脫水前用54 56°C的切片石蠟將樣品包埋定位， 方便以后的操作。4、透明采用1:1 (體積比)的二甲苯乙醇過度方法，具體透明過程如下1:1 二甲苯:100% 乙醇 20min, 二甲苯 15min, 二甲苯 15min。5、透蠟、包埋和切片透蠟采用熔點為54 56°C的切片石蠟，透蠟程序如下透蠟2 次，每次I. 5h，透蠟后由包埋機完成包埋，仍為54 56°C的切片石蠟；采用普通生物切片機切片，切片厚度為7 μ m ;用恒溫水浴本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種花生籽仁的石蠟切片方法，其特征在于，包括以下步驟：1）取材；2）固定：采用體積濃度為5%~10%戊二醛固定；3）脫水：80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度至少2次脫水過程；4）透明：體積比1:1二甲苯:100%乙醇處理20~30min，二甲苯處理15~25min，二甲苯處理15~25min；5）透蠟、包埋和切片：采用熔點為54~56℃的切片石蠟直接透蠟2次，每次1.5~2h，透蠟后包埋、切片；6）脫蠟、染色和封片：脫蠟：二甲苯30~40min，重復1次；復水：100%乙醇2~3min，重復1次；95%乙醇2~3min，重復1次；80%乙醇2~3min，重復1次；50%乙醇2~3min；蒸餾水2~3min；復染：蘇木素染液6~8min，蒸餾水沖洗5~7min，曙紅染液染色3min15s~4min；脫水：95%乙醇2~3min，重復1次，100%乙醇2~3min，重復1次；透明：二甲苯2~3min，重復3次；封片。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：單世華，閆彩霞，李春娟，張廷婷，許婷婷，
申請(專利權)人：山東省花生研究所，
類型：發明
國別省市：