本發明專利技術屬分子生物學特別是糖生物學領域，涉及檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒。具體涉及一種檢測CA125表面Tn抗原的的抗體-凝集素ELISA試劑盒。所述試劑盒通過包被在96孔板上的CA125抗體捕獲血清中的CA125，繼而利用特異性識別Tn抗原的凝集素VVA檢測CA125表面Tn抗原含量，可用于判斷CA125升高患者是否患有惡性婦科腫瘤。本發明專利技術所述的試劑盒檢測省時，所需血清樣本易于取得，用于區分良惡性CA125升高患者準確度高。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬分子生物學特別是糖生物學領域，涉及檢測CA125(cancer antigenl25,癌抗原125)表面Tn抗原的試劑盒。具體涉及一種檢測CA125表面Tn抗原的的抗體-凝集素ELISA試劑盒。
技術介紹
現有技術公開了癌抗原125是一種高度糖基化的粘蛋白，其中糖鏈部分約占整個分子質量的20%-70%。有研究表明，約80%的上皮性卵巢癌患者血清CA125水平升高，其水平的顯示能夠很好的反應機體腫瘤負荷，因此，癌抗原1 25 (cancer antigen 125, CA125)成為目前婦科最常用的血清腫瘤標志物以及臨床卵巢癌治療后的主要監測隨訪指標。據研究顯示，除了卵巢癌，血清CA125水平在許多其他良、惡性疾病中也發現有異常升高，如血清CA125水平在1%左右的健康女性中有升高，在6%左右的子宮內膜異位癥、盆腔炎、妊娠等婦產科良性疾病中有升高，在肝硬化、慢性活動性肝炎、急性心衰等內科疾病以及部分胰腺癌、肺癌、肝癌等其他系統癌癥患者中也有升高。此外，無論良性或惡性腹水患者，其血清CA125水平都顯示有異常升高。據臨床診斷發現，目前婦科良性疾病出現了較高的發病率，如子宮內膜異位癥在育齡婦女中發病率高達15%以上，同時其臨床表現如盆腔包塊、盆腔積液等與卵巢癌臨床表現類似，因此，致使對其的診療方案的制定帶來了困難，且給有關患者帶來不必要的精神負擔。大量的研究表明，惡性腫瘤常伴隨著糖鏈合成、降解以及連接相關分子的異常改變，從而導致其合成的蛋白出現異常糖基化狀態。生理狀況下，所述CA125由苗勒氏管上皮，即輸卵管內膜、子宮內膜(包括增生期、分泌期和孕期)以及宮頸內膜，腹膜、胸膜以及心包膜等間皮組織，支氣管上皮、支氣管粘膜下腺，以及角膜和結膜上皮合成分泌。在卵巢癌患者中，癌組織能表達高水平的CA125，并分泌入血，因此，卵巢癌患者血清中的CA125主要來源于癌組織，且具有特殊的糖基化狀態。本領域研究者試圖利用上述糖基化狀態差異，區分良性或惡性疾病引起的CA125升高，從而進一步提高臨床診斷的準確性，但迄今為止，尚未見有關用于CA125表面Tn抗原檢測的抗體-凝集素ELISA試劑盒的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，尤其是一種用于CA125表面Tn抗原檢測的抗體_凝集素ELISA試劑盒；本專利技術的試劑盒能通過包被在96孔板上的CA125抗體捕獲血清中的CA125，繼而利用特異性識別Tn抗原的凝集素VVA檢測CA125表面Tn抗原含量，可用于判斷CA125升高患者是否患有惡性婦科腫瘤。具體而言，本專利技術的用于CA125表面Tn抗原檢測的抗體-凝集素ELISA試劑盒，其特征在于，其包被一種抗CA125抗體(克隆號[X325])，通過包被的CA125抗體捕獲血清中的CA125，用糖鏈識別分子檢測CA125表面Tn抗原含量。本專利技術的試劑盒的檢測原理采用雙抗體夾心法ELISA ；本專利技術的試劑盒的檢測對象為婦科病患者血清；本專利技術的試劑盒適用人群為血清CA125水平升高的婦科病患者血清，尤其是血清CA125水平大于35U/ml的患者人群；本專利技術試劑盒的糖鏈識別分子為特異性識別Tn抗原的凝集素VVA。本專利技術中，所述的CA125抗體是一種糖蛋白，由于其Fe段的糖鏈有可能與凝集素發生結合，從而干擾抗原糖鏈結構的檢測，因此，本專利技術的試劑盒的制備中引入了抗體糖鏈氧化衍生化處理步驟，其中使用(4-[4-N-馬來酰亞胺]鹽酸丁酸肼)(4- [4-N-maleimidophenyl] butyric acid hydrazide hydrochlorid, MPBH)作為交連劑，利用其酰肼末端與高碘酸鈉氧化糖環產生的醛基結合，利用馬來酰亞胺末端與半胱氨酸-甘 氨酸二肽上的巰基結合，從而在結構上破壞Fe段糖鏈，同時利用空間位阻效應防止凝集素與其結合，最終降低抗體糖鏈所產生的背景信號。本專利技術中，所述試劑盒的CA125抗體包被于96孔板后經氧化衍生化處理以清除抗體糖鏈引起的背景信號；其中，所述的氧化衍生化處理中，氧化液為含20mM NaIO4的O. IM醋酸鈉溶液，PH5. 5 ;衍生化試劑為溶于PBS的ImMMPBH ;封閉液為溶于O. IPBST的O. ImMCys-Gly0本專利技術進一步提供了利用特異性識別Tn抗原的凝集素VVA檢測CA125表面Tn抗原含量，以進行判斷CA125升高是否為惡性婦科腫瘤的方法。本專利技術的用于CAl25表面Tn抗原檢測的抗體-凝集素ELISA試劑盒，對收集的血清CA125水平升高的90余例婦科病患者的血清進行體外檢測，其包括步驟I)收集血清樣本，按常規血清分離方法處理；2)抗體糖鏈衍生化；3)凝集素檢測CA125表面Tn抗原；4)計算CA125表面Tn抗原含量X-Log10 (Asample/Ablank)其中，X為CA125表面Tn抗原相對含量，Asample為樣品孔的吸光度，Ablank為空白對照孔德吸光度；根據特異性識別Tn抗原的凝集素VVA檢測CA125表面Tn抗原含量，判斷CA125升高患者是否患有惡性婦科腫瘤。結果顯示，以O. 2為界值，CA125表面Tn抗原診斷惡性CA125升高的靈敏度和特異度分別為82. 5%和74. 5%。本專利技術的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒可用于診斷惡性婦科腫瘤。與現有技術比較，本專利技術的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，具有檢測省時，所需血清樣本易于取得，用于區分良、惡性CA125升高患者準確度高的優點。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實施例對本專利技術進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例和附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本專利技術的范圍內對本專利技術做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本專利技術的范圍內。附圖說明圖I顯示了 CA125表面Tn抗原診斷、CA125升高的靈敏度和特異度。具體實施例方式本專利技術將通過具體的實施例進行示例性的說明，其中，如有未盡之處，可參見《分子克隆實驗指南(第三版)》(科學出版社，北京)等實驗手冊以及市售的試劑和儀器的使用說明。實施例II)收集血清樣本收集血清CA125水平升高的婦科病例91例，包括40例惡性婦科腫瘤患者，51例婦 科良性疾病患者；按常規血清分離方法，首先抽取5ml靜脈血，促凝管中凝固后2000g離心10分鐘，吸出上層血清，-80°C凍存，使用前4°C解凍。2)抗體糖鏈衍生化(I)包被CA125 抗體(克隆號[X325])以包被液(ρΗ9· 6，O. 05MNa2C03_NaHC03 溶液)稀釋至I μ g/ml,加入酶標板,100 μ I/孔，4°C,過夜；(2)洗板0. lPBST,200y I/ 孔，洗板三次；(3)封閉封閉液(含 1%BSA 的 1*PBS)，200 μ I/ 孔，37。。，Ih ；(4)氧化:氧化液(含 20mM NaIO4 的 O. IM 醋酸鈉溶液，pH5. 5)，200 μ I/孔，4°C，避光，2. 5h ；(5)洗板0. lPBST，200y I/孔，洗板三次；(6) MPBH :MPBH 工作液(ImM 溶于 PBS)，200 μ I/孔，室溫，2h ；(7)洗板0. lPBST,200本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，其特征在于，其包被一種抗CA125抗體，通過包被的CA125抗體捕獲血清中的CA125，用糖鏈識別分子檢測CA125表面Tn抗原含量；所述抗CA125抗體的克隆號為[X325]。
【技術特征摘要】
1.一種檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，其特征在于，其包被一種抗CA125抗體，通過包被的CA125抗體捕獲血清中的CA125，用糖鏈識別分子檢測CA125表面Tn抗原含量； 所述抗CA125抗體的克隆號為[X325]。2.按權利要求I所述的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，其特征在于，其采用雙抗體夾心法ELISA。3.按權利要求I所述的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，其特征在于，檢測對象為婦科病患者血清。4.按權利要求I或3所述的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，其特征在于，所述的血清是CA125水平大于35U/ml的婦科病患者血清。5.按權利要求I所述的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒，其特征在于，所述的糖鏈識別分子是特異性識別Tn抗原的凝集素VVA。6.制備權利要求I的檢測CA125表面Tn抗原的試劑盒的方法，其特征在于，其包括抗體糖鏈氧化衍生化處理步驟其中，采用(4-[4-N-馬來酰亞胺]鹽酸丁酸肼)作為交連劑，用其酰肼末端與高碘酸鈉氧化糖環產生的醛基結合，用馬來酰亞胺末端與半胱氨酸-甘氨酸二肽上的巰基結合，以在結構上破壞Fe段糖鏈，和用空間位阻效...
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐叢劍，王宜生，堯良清，劉曉艷，李小平，孫立新，曹銳，高迎春，張蓉，金志軍，滕銀成，陸佳琦，程明軍，張曉燕，
申請(專利權)人：復旦大學附屬婦產科醫院，
類型：發明
國別省市：
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