一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒制造技術(shù)

本實(shí)用新型專利技術(shù)公開了一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有7個(gè)下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個(gè)下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個(gè)底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。本實(shí)用新型專利技術(shù)提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒具有較好的特異性，尤其是對(duì)于CoxA16無交叉反應(yīng)性；雙人對(duì)于EV71純化前、后的樣品進(jìn)行抗原含量重復(fù)檢測(cè)，重復(fù)性良好，線性較好；對(duì)于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測(cè)。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本技術(shù)涉及一種酶聯(lián)診斷試劑盒及其用途，具體說，是涉及一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，屬于醫(yī)學(xué)、生物

技術(shù)介紹
腸道病毒71型(英文名為Human enterovirus 71),簡(jiǎn)稱EV71 :EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結(jié)構(gòu)。由于EV71引起的手足口病(hand - footand mouth disease ;HFMD)影響范圍的廣泛性、危害的嚴(yán)重性,該病在中國已納入丙類傳染病管理。鑒于此，世界各國學(xué)者、生物公司正致力于EV71病毒疫苗的研究。EV71病毒屬于小RNA病毒科，病毒顆粒為典型的正二十面體結(jié)構(gòu)。其基因組為單股正鏈RNA,長(zhǎng)度約為7，408個(gè)核苷酸,編碼開放讀碼框(open-reading frame, 0RF)。EV71基因組編碼的多聚蛋白(polyprotein)約含2，193個(gè)氨基酸,該多聚蛋白可進(jìn)一步被水解成Pl、P2、P3三個(gè)前體蛋白(圖I)。經(jīng)過進(jìn)一步的剪切，Pl前體蛋白可以進(jìn)一步成熟為VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)責(zé)病毒顆粒的裝配和穩(wěn)定；P2前體蛋白則進(jìn)一步成熟為非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein, nsp)2A(特異性蛋白酶)、2B和2C ；P3前體蛋白則用以形成非結(jié)構(gòu)蛋白3A、3B (VPg，5’末端結(jié)合蛋白)、3C (特異性蛋白酶)和 3D(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)。腸病毒的流行與季節(jié)轉(zhuǎn)換、環(huán)境變異有著極大的關(guān)聯(lián)性，腸病毒只在夏季及初秋流行，每年六 九月為高峰期，氣溫過低的地區(qū)并不利于腸病毒生存。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，腸病毒之傳染途徑主為糞一口傳染(stool - oral)，感染腸病毒的患者會(huì)經(jīng)由糞便排出病毒，這些含有高濃度腸病毒的糞便會(huì)污染環(huán)境甚至地下水源，在公共衛(wèi)生條件不佳的地區(qū)，極易經(jīng)由污染的水源而散播該病毒。EV71對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)有極高的感染性，故臨床上出現(xiàn)之癥狀包括腦炎(encephalitis)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)、急性無力肢體麻痹(acute flaccid paralysis)、手足口癥(hand - foot - mouth disease)、泡疫性咽峽炎(herpangina)、急性出血性結(jié)膜炎(acute hemorrhagic conjuctivitis)、肌肉僵直(myoclonic jerk)、頭痛(headache)、發(fā)燒(fever)及嘔吐(vomoting)等，而其中以手足口癥及泡疹性咽峽炎最為常見。一般而言，感染腸病毒多為無癥狀(約50 80%)或出現(xiàn)輕微類似感冒的癥狀，病人會(huì)自然痊愈而產(chǎn)生抗體，但因感染腸病毒且轉(zhuǎn)成重癥之患者卻有極高的機(jī)率死于心肺衰竭及廣泛性的腦干傷害，實(shí)不容小覷。加強(qiáng)對(duì)EV71型感染病患的防控工作，已成為我國病毒性傳染病管理工作的目標(biāo)之一。而相關(guān)疫苗的研究開發(fā)和病毒抗原的快速檢測(cè)試劑盒是預(yù)防控制此傳染病的關(guān)鍵。在EV71病毒所編碼的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1、VP2和VP3主要用來形成包裝病毒顆粒的衣殼(capsid)，而VP4則被包埋在病毒衣殼的內(nèi)部，負(fù)責(zé)與核心(core)相互作用，用以穩(wěn)定病毒的基因組，因此VP1、VP2和VP3形成了 EV71病毒的主要抗原決定簇，其中又以VPl的抗原性最強(qiáng)，而成為目前抗體研究與設(shè)計(jì)開發(fā)的主要靶點(diǎn)。同時(shí)，研究表明腸道病毒存在著眾多的型內(nèi)、型間的交叉反應(yīng)性，并且存在著較高的重組性。其中EV71與Cox A16的相似性達(dá)到了 80%，擁有很多共同表位，許多克隆抗體EV71的單抗具有了與Cox A16的交叉反應(yīng)性。成為EV71抗原檢測(cè)方法建立的一項(xiàng)制約。常規(guī)的針對(duì)EV71病毒的診斷方法主要通過分離病毒，中和抗體檢測(cè)和免疫組織化學(xué)法來進(jìn)行。但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，無法滿足疾病流行期間同時(shí)大量處理大量標(biāo)本的需要。同時(shí)，鑒于EV7·1病毒的危害性,有必要開發(fā)一種簡(jiǎn)單快速易行的檢測(cè)EV71病毒抗原表位含量的檢測(cè)方法。該研究使用的特異性識(shí)別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體具有高效的EV71病毒的中和效果，同時(shí)與Cox A16交叉反應(yīng)性，有效避免了抗原檢測(cè)中與EV71 80%相似性的Cox A16的假陽性干擾。因此，所述方法的成功開發(fā)對(duì)于疫苗的研發(fā)中抗原表位這一有效組分的檢測(cè)有著重要的意義，同時(shí)該方法也為EV71疾病的防治、早期篩查、診斷工作提供了準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、有效的監(jiān)測(cè)手段，具有廣泛的應(yīng)用范圍和社會(huì)需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本技術(shù)的目的是提供一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本技術(shù)采用的技術(shù)方案如下一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)置有7個(gè)下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個(gè)下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個(gè)底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。作為一種優(yōu)選方案，所述的抗EV71抗體為特異性識(shí)別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段，且可被生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的；所述陽性對(duì)照品為EV71抗原對(duì)照品；所述陰性對(duì)照品為陰性血清；所述的標(biāo)記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性磷酸酶標(biāo)記或葡萄糖氧化酶標(biāo)記或是熒光素、生物素、膠體金離子標(biāo)記的。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板相鄰；且所述封板膜與所述多孔酶聯(lián)板的大小一致。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數(shù)條可拆卸的微孔反應(yīng)板條，每條微孔反應(yīng)條上設(shè)有數(shù)個(gè)可拆卸的微反應(yīng)孔。作為進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述多孔酶聯(lián)板上共設(shè)有96個(gè)微反應(yīng)孔，且所述多孔酶聯(lián)板外設(shè)有封套。作為更進(jìn)一步優(yōu)選方案，所述樣品稀釋液通過在牛血潰白蛋白IOg加入0.01 MPBS IOOOml和混合生物素防腐劑O. 5ml即得；所述濃縮洗液為取NaH2PO4. 2H20 2. 96g、Na2HPO4. 12H20 29. 0g、NaCl 234g 和 Tween-20 20ml 加純化水至 1000ml 即得；所述終止液為取濃硫酸112ml加入純化水888ml即得；所述顯色液A為取醋酸鈉27. 2g、檸檬酸3.2g、30%H2020. 6ml加入雙蒸水至IOOOml即得；所述顯色液B為取ΤΜΒ0. 4g,EDTA-Na2O. 4g、檸檬酸I. 9g、甘油IOOml加入雙蒸水至IOOOmlo本技術(shù)提供的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒具有較好的特異性，尤其是對(duì)于Cox A16無交叉反應(yīng)性；雙人對(duì)于EV71純化前、后的樣品進(jìn)行抗原含量重復(fù)檢測(cè)，兩人的變異系數(shù)〈10%，重復(fù)性良好；3次的線牲相關(guān)系數(shù)均>0. 99，線性較好；對(duì)于EV71病毒純化前后的樣品、鋁佐劑吸附EV71樣品均能較好的檢測(cè)。采用本技術(shù)提供的試劑盒，可快速、準(zhǔn)確有效地的對(duì)手足口病感染患者進(jìn)行EV71檢測(cè)，從而為EV71病毒感染診斷和預(yù)防提供了一種新本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于：它包括盒體，盒體內(nèi)置有7個(gè)下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個(gè)下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個(gè)底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于它包括盒體，盒體內(nèi)置有7個(gè)下凹瓶位，7瓶設(shè)有密封蓋的試劑瓶、一塊多孔酶聯(lián)板及一張封板膜，其中所述的7個(gè)下凹瓶位內(nèi)分別相應(yīng)放置裝有陽性參考品、陰性參考品、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色液A、顯色液B和終止液各一瓶，所述的多孔酶聯(lián)板包括數(shù)個(gè)底面封閉且頂面敞口的微反應(yīng)孔的內(nèi)壁包被有抗EV71抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的EV71抗原酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的抗EV71抗體為特異性識(shí)別EV71病毒Vpl中保守區(qū)域基因的單克隆抗體或其保守性突變體或活性片段，且可被生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的； 所述陽性對(duì)照品為EV71抗原對(duì)照品； 所述陰性對(duì)照品為陰性血清； 所述的標(biāo)記是辣根過氧化物酶、丙酮酸激酶、堿性...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：史晉，吳克，劉昊智，鮑路偉，王文灝，程超，張愛暉，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：上海博沃生物科技有限公司，
類型：實(shí)用新型
國別省市：