一種檢測急性心梗的試紙、試紙制備及應(yīng)用方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種檢測急性心梗的試紙、試紙制備及應(yīng)用方法，試紙包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊；其中，結(jié)合墊包被有葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物；層析膜上具有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，檢測帶上固定有單克隆抗體；質(zhì)控帶固定有能與葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物特異結(jié)合的兔抗鼠IgG抗體，本發(fā)明專利技術(shù)試劑的敏感范圍達(dá)到0.1ng/mL，并且可實(shí)現(xiàn)心肌梗塞病人血清中微量肌紅蛋白、肌鈣蛋白I和肌酸激酶同工酶定量檢測，點(diǎn)樣后3-5分鐘即可得到結(jié)果，操作簡便，不需要專業(yè)人員操作。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及免疫診斷試劑領(lǐng)域，具體為涉及一種檢測急性心梗的試紙、試紙制備及應(yīng)用方法。
技術(shù)介紹
隨著我國人口老齡化進(jìn)程的加劇，急性心肌梗塞已成為危害中國的重大疾病。世界衛(wèi)生組織指出全球每年有850萬人死于急性心肌梗塞。在我國，急性心肌梗塞每年患者為2千萬人，而有100萬人被急性心肌梗塞奪去生命。因而急性心肌梗塞已經(jīng)成為危害國人健康的重大疾病。治療顯示，急性心肌梗塞發(fā)病后3小時(shí)內(nèi)是治療的至關(guān)重要時(shí)間。只有對心肌梗塞患者進(jìn)行早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早救治，才能最大程度挽救患者生命，最大程度改善患者預(yù)后。 尋找早期心肌損傷標(biāo)志物是早期診斷心肌梗塞的關(guān)鍵。目前研究表明人肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白I可以疾病發(fā)作后可釋放到外周血，可作為心肌梗塞診斷的特異性指標(biāo)。目前，國內(nèi)檢測心肌梗塞主要免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)和金標(biāo)免疫試紙條。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法涉及加樣、溫浴、洗滌、顯色、終止等多個步驟，至少需要3小時(shí)，另外，需要在檢驗(yàn)科或中心實(shí)驗(yàn)室完成，因而不可能在急性心肌梗塞發(fā)病后病人家庭，急救車展開。另外酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法靈敏度只能達(dá)到10ng/ml，如果要對10ng/ml以下的物質(zhì)進(jìn)行檢測，就會產(chǎn)生假陰性的結(jié)果，即漏檢。免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物的一種的免疫技術(shù)。相比之下，膠體金技術(shù)的敏感性比酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法更差，只能達(dá)到50ng/ml，要對人肌紅蛋白、肌鈣蛋白I、肌酸激酶同工酶的微量檢測幾乎是不可能的，另外目前國內(nèi)膠體金技術(shù)尚屬于起步階段，基本上不能對上述指標(biāo)的定量。鑒于以上特征，目前國內(nèi)乃至世界在診斷急性心肌梗塞上迫切需要建立一個能夠及時(shí)、高敏感性、定量檢測系統(tǒng)，并將上述檢測系統(tǒng)用于急性心肌梗塞產(chǎn)品的開發(fā)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷和問題，本專利技術(shù)實(shí)施例的目的是提供能用于檢測急性心梗的一種檢測急性心梗的試紙、試紙制備及應(yīng)用方法。為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)實(shí)施例提供如下技術(shù)方案一種檢測急性心梗的試紙，包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊；其中，結(jié)合墊包被有葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物；層析膜上具有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，檢測帶上固定有單克隆抗體；質(zhì)控帶固定有能與葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物特異結(jié)合的兔抗鼠IgG抗體。本專利技術(shù)還提供一種檢測急性心梗的試紙制備方法，包含以下步驟(I)用稀釋液將葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物稀釋到濃度至O. 01-0. 03mg/ml范圍內(nèi)，然后將結(jié)合墊浸泡在稀釋液中，經(jīng)過烘干或者真空冷凍干燥后，再裝配到試紙條底板上；稀釋液的組成為pH7.4 O. OlM的PBS緩沖液中加入質(zhì)量百分比O. 1% NaN3、質(zhì)量百分比 1% BSA。(2)在層析膜上設(shè)置兩條帶，一條檢測帶和一條質(zhì)控帶；檢測帶上固定單克隆抗體，所述克隆抗體為抗肌紅蛋白、肌鈣蛋白I和肌酸激酶同工酶單克隆抗體的一種；質(zhì)控帶固定兔抗鼠IgG抗體；(3)在步驟(2)的層析膜的一側(cè)貼上樣品吸收墊和結(jié)合墊，另一側(cè)貼上吸水墊；樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜的檢測帶、層析膜的質(zhì)控帶和吸水墊依次排布。本專利技術(shù)還提供一種檢測急性心梗的試紙應(yīng)用方法，包含以下步驟(I)在樣品吸收墊上加入待測血清樣品；在毛細(xì)作用下，樣品液向吸水墊一端泳動，在結(jié)合墊處與葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物形成免疫復(fù)合物，再進(jìn)一步泳動，免疫 復(fù)合物與檢測帶處的單克隆抗體結(jié)合形成類似雙抗體夾心的免疫復(fù)合物，剩余的熒光標(biāo)記抗體移動至控制線反應(yīng)形成條帶，為陽性結(jié)果；(2)通過熒光檢測裝置檢測；(3)結(jié)果的判斷檢測帶不顯示，質(zhì)控帶顯示條帶，表明試紙條有效，待測樣品不含所測抗原；檢測帶顯示條帶，質(zhì)控帶顯示條帶，表明待測樣品含有所測抗原；檢測帶不顯示，質(zhì)控帶不顯示，表明試紙條無效；檢測帶顯示條帶，質(zhì)控帶不顯示，表明試紙條無效。本專利技術(shù)將葡聚糖-抗體-突光素混合標(biāo)記的信號放大系統(tǒng)技術(shù)與傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)一種具有高靈敏度的熒光定量試紙用于診斷急性心肌梗塞。本熒光定量試紙通過熒光強(qiáng)度變化來反應(yīng)樣品中的抗原含量，可實(shí)現(xiàn)抗原的特異定量檢測。這對于心肌梗塞的早期診斷、心肌梗塞的嚴(yán)重程度評估、治療方案選擇和預(yù)后判斷具有重要的意義。同時(shí)本熒光試紙中的葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記的信號放大系統(tǒng)技術(shù)能夠?qū)㈧`敏度提高至O. lng/ml，這對于檢測血清中微量物質(zhì)是極重要的。另外，此高靈敏度熒光定量診斷試紙3-5分鐘內(nèi)即可觀察結(jié)果，標(biāo)本用量少，可檢測人血清/血漿中人肌紅蛋白、人肌鈣蛋白I及人肌酸激酶同工酶三項(xiàng)指標(biāo)，這對于早期診斷心肌梗塞是極重要的。本專利技術(shù)產(chǎn)品為臨床診斷心肌梗塞提供了敏感、特異、快捷的新手段。本專利技術(shù)相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果(I)特異性，利用抗原與抗體特異反應(yīng)原理檢測人肌紅蛋白、肌鈣蛋白I和肌酸激酶同工酶，其相對特異性可分別達(dá)到96. 6%, 97. 0%, 98. 0% ；(2)敏感性，采用葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記技術(shù)信號放大技術(shù)，可將診斷試劑的敏感范圍從lO-lOOng/mL推進(jìn)到O. Ing/mL,即敏感性提高了 100-1000倍,并且可實(shí)現(xiàn)心肌梗塞病人血清中微量肌紅蛋白、肌鈣蛋白I和肌酸激酶同工酶定量檢測；(3)快速性，本專利技術(shù)開發(fā)產(chǎn)品點(diǎn)樣后3-5分鐘即可得到結(jié)果；(4)簡便性，本專利技術(shù)開發(fā)產(chǎn)品操作簡便，不需要專業(yè)人員操作。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術(shù)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的圖僅僅是本專利技術(shù)的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些圖獲得其他的圖。圖I是本專利技術(shù)所提供的試紙條的結(jié)果判讀示意圖，其中T為檢測帶，C為質(zhì)控帶。圖2是本專利技術(shù)提供的試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品吸收墊，2為結(jié)合墊，3為層析膜，4為底板,5為吸水墊。具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本專利技術(shù)的圖，對本專利技術(shù)的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本專利技術(shù)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本專利技術(shù)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本專利技術(shù)保護(hù)的范圍。本專利技術(shù)的原理是本專利技術(shù)所涉及的檢測方法是雙抗體夾心法，一個是包被抗體，一個是標(biāo)記抗體，對血清中的抗原進(jìn)行檢測，常規(guī)抗體標(biāo)記采用辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，但是辣根過氧化物酶標(biāo)記存在敏感性差的問題。熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)，可極大提高檢測試劑的敏感性。就標(biāo)記抗體而言，常規(guī)的熒光素標(biāo)記只有少量熒光素分子，與單位抗體結(jié)合，因 而其陽性信號/背景信號之間的讀數(shù)比值過低。本專利技術(shù)特別使用葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記技術(shù)。基于每個葡聚糖分子能含有1000個divinyls μ Ifone (二乙烯砜)活性基團(tuán)，除少部分的divinylsy Ifone活性基團(tuán)自身偶聯(lián)之外，形成類似口罩的結(jié)構(gòu)，每個葡聚糖分子中絕大部分的divinyls μ Ifone活性基團(tuán)可與熒光素或抗體分別進(jìn)行偶聯(lián)。因此，先將葡聚糖活化與成百上千的熒光素分子結(jié)合，結(jié)合后的葡聚糖一熒光素混合物再與抗體結(jié)合，利用這種技術(shù)陽性信號/背景信號之間的讀數(shù)比值成百上千的提高。本專利技術(shù)所提供的熒光免疫試紙，原理包括雙抗體夾心法和間接法兩種免疫學(xué)方法。雙抗體夾心法是檢測帶的反應(yīng)方法本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于：包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊；其中，結(jié)合墊包被有葡聚糖？抗體？熒光素混合標(biāo)記物；層析膜上具有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，檢測帶上固定有單克隆抗體；質(zhì)控帶固定有能與葡聚糖？抗體？熒光素混合標(biāo)記物特異結(jié)合的兔抗鼠IgG抗體。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于包括底板、附著在底板上依次緊密相連的樣品吸收墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊；其中，結(jié)合墊包被有葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物；層析膜上具有一條檢測帶和一條質(zhì)控帶，檢測帶上固定有單克隆抗體；質(zhì)控帶固定有能與葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物特異結(jié)合的兔抗鼠IgG抗體。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述單克隆抗體為抗肌紅蛋白、肌鈣蛋白I和肌酸激酶同工酶之一。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于其中所述單克隆抗體的制備步驟為 (O使用單克隆抗體免疫抗原免疫小鼠；分別以單克隆抗體抗原與等量弗氏完全佐劑乳化后，采用皮下多點(diǎn)注射方式對4只4周齡的雌性BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫；初免后加強(qiáng)免疫數(shù)次； (2)篩選抗單克隆抗體； A、將IXlO8脾細(xì)胞與2X107骨髓瘤細(xì)胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM培養(yǎng)基至30mL; IOOOrpm離心7min,將上清盡量吸凈； B、在手掌上輕擊融合管底部，使沉淀細(xì)胞松散均勻，置40°C水浴中預(yù)熱，用ImL吸管在I分鐘內(nèi)加預(yù)熱至40°C的50%，邊加邊輕輕搖動混勻，用5mL吸管在90秒內(nèi)加25mL預(yù)熱至370C的不完全DMEM培養(yǎng)基，室溫靜置lOmin，800rpm離心7分鐘，棄上清； C、加入5M1HAT完全培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加HAT培養(yǎng)基至90mL，分裝至融合前一天培養(yǎng)的含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μ L ;培養(yǎng)板置37°C 5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； D、培養(yǎng)至第5天，用HT完全培養(yǎng)基換出孔內(nèi)1/2HAT培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第7天，用HT培養(yǎng)基換出孔內(nèi)全部培養(yǎng)液； E、每天觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況，待雜交瘤細(xì)胞長至10%以上孔底面積時(shí)，吸出培養(yǎng)液，進(jìn)行抗體檢測；用競爭抑制ELISA方法，篩選出分泌抗細(xì)菌脂多糖和脂溶性蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞； (3)腹水生產(chǎn)，選用標(biāo)準(zhǔn)BALB/c小鼠，先用降植烷進(jìn)行小鼠腹腔注射，一周后每只老鼠按照5X106雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去；I周后采集腹水，將腹水置于37°C靜置2小時(shí)后，13000rpm離心lOmin，除去細(xì)胞成分和其他的沉淀物，收集上清，再過玻璃纖維柱,收集到澄清的腹水； (4)抗體純化，采用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行初步純化，取ImL透析后粗提物加入ImL預(yù)裝柱，用pH=7. 4的PBS進(jìn)行洗滌，加入pH=2. 7的ImL的IOOmM甘氨酸進(jìn)行洗脫，重復(fù)6次；收集流出液，ImL/管，并用50 μ I IM Tris中和反應(yīng)。4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述的兔抗鼠IgG抗體的制備步驟為 (1)用含鼠IgG的免疫原多次免疫家兔； (2)收集、分離得到含有兔抗鼠IgG抗體的血清； (3)將抗體血清加入到親和層析柱中純化得到兔抗鼠IgG抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述的葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物制備步驟為(1)將熒光素分子與以親水鏈為骨架的葡聚糖分子反應(yīng)，得到結(jié)合熒光素的葡聚糖分子; (2)將結(jié)合熒光素的葡聚糖分子與抗體反應(yīng),純化,得到葡聚糖、抗體和熒光素混合標(biāo)記物。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述的葡聚糖優(yōu)選為分子量20，000 30，000的葡聚糖。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述的熒光素優(yōu)選為異硫氰酸熒光素。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述的純化優(yōu)選通過凝膠層析法進(jìn)行分離純化。9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢測急性心梗的試紙，其特征在于所述的葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物制備步驟 (O結(jié)合熒光素的葡聚糖分子的制備用有機(jī)溶劑溶解熒光素，在磁力攪拌條件下，滴加在含葡聚糖的醋酸溶液中，避光反應(yīng)，使得熒光素上的碳原子與葡聚糖上的二乙烯砜反應(yīng)以便進(jìn)行標(biāo)記偶聯(lián)；反應(yīng)結(jié)束后，將PH值調(diào)至8. 8-9. 2，離心，取沉淀，得到結(jié)合熒光素的葡聚糖分子； (2)葡聚糖-抗體-熒光素混合標(biāo)記物初產(chǎn)物的制備洗滌步驟(I)得到的沉淀，再用醋酸溶液溶解沉淀，接著將PH值調(diào)節(jié)為4. 8-5. 2 ;在磁力攪拌條件下，滴加入抗體溶液，抗體加入的量按Img熒光素加入IOOmg免疫球蛋白計(jì)算，進(jìn)行反應(yīng)后得到葡聚糖...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：江建華，
申請(專利權(quán))人：江建華，
類型：發(fā)明
國別省市：