本發明專利技術涉及一種腫瘤標志物糖類抗原50（CA50）的磁微粒化學發光免疫檢測方法，屬于免疫檢測分析技術領域。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的CA50單克隆抗體和堿性磷酸酶（AP）標記的單克隆抗體與抗原結合，形成FITC標記抗體-抗原-AP標記抗體的夾心免疫復合物，類似“三明治”結構。隨后加入連有抗FITC抗體的磁性微粒，通過抗FITC抗體與FITC的特異性結合使抗原抗體復合物連接在磁顆粒上，在外加磁場中直接沉淀，不需離心即可將免疫反應形成的復合物與未結合的其它物質分離。本發明專利技術試劑盒將化學發光與磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，本發明專利技術試劑盒具有更高的靈敏度、線性范圍寬、快速等諸多優點，并且大大降低了產品成本，在臨床檢驗等方面具有廣闊的應用前景。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于免疫檢測分析
，涉及檢測血清中腫瘤標志物CA50含量的磁微粒化學發光免疫分析試劑盒及其測試方法
技術介紹
腫瘤標志物(tumor mark, TM)是指腫瘤細胞分泌或脫落到體液或組織中的物質，或是宿主對體內寄生物反應而產生并進入到體液或組織中的物質。目前臨床上常用的腫瘤標志物大多是非特異性標志物，這些標志物在良性腫瘤和正常組織中也有出現，但在腫瘤 發生時，其水平明顯提高。由于這類標志物沒有腫瘤特異性，因此又稱為廣譜性腫瘤標志物。CA50是由Lindbolm等(1983)發現的一種非特異性廣譜腫瘤標志物，其在消化道腫瘤和其它系統腫瘤中均有很好的應用價值。CA50是一種以唾液酸脂和唾液酸糖蛋白為主要成分的糖類抗原，廣泛存在于胰腺、膽囊、肝、胃、結直腸、膀胱、子宮，正常組織中一般不存在。當細胞惡變時，糖基轉化酶的失活或胚胎期才活躍的某些轉化酶又被激活，造成細胞表面糖基結構改變從而形成CA50。經研究證實在多種惡性腫瘤患者血中CA50皆有升高，對胰腺癌和膽囊癌的陽性檢出率居首位(90%以上)，其次為卵巢或子宮頸癌、肝癌、結腸/直腸癌、膀臟癌、胃癌、肺癌。因此，CA50在臨床上主要用于對胰腺癌、膽囊癌、肝癌、胃癌及卵巢癌等腫瘤診斷有較高價值，此外還可作為評價腫瘤術后手術效果的指標。化學發光免疫檢測技術于上個世紀80年代，繼酶聯免疫技術和放免技術之后發展起來的新興技術，相對于后兩者化學發光免疫技術具有高靈敏度、高特異性，操作簡便、快速，標記結合物穩定，同時無放射性同位素損傷和污染等特點，因此近年來在臨床檢測分析中被廣泛推廣使用。
技術實現思路
本專利技術需要解決的技術問題在于提供一種糖類抗原50 (CA50)定量測定試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒進行CA50檢測具有較高的靈敏度和特異性，操作更簡便，檢測時間更短。本專利技術提供了檢測CA50化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括磁微粒試劑；CA50校準品；CA50質控品；CA50抗試劑；清洗濃縮液；發光底物溶液；樣本稀釋液。所述的磁微粒試劑為連接羊抗FITC抗體的磁微粒溶液； 所述的校準品及質控品為含有一定量CA50抗原的BSA緩沖液； 所述的抗試劑是由堿性磷酸酶(AP)標記的CA50單克隆抗體及異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CA50單克隆抗體的混合液； 所述的清洗濃縮液是含有Tris、NaCl和表面活性劑等的緩沖液；所述的發光底物溶液是含Lumigen APS-5發光液的緩沖液； 所述的樣本稀釋液是含有BSA的溶液。本專利技術所提供的檢測CA50的樣品前處理方法，包括以下步驟 I、樣品前處理 對臨床血清，3000rpm離心5分鐘，取上層液即可進行分析測定。待測樣品2_8°C存放不得超過48小時，若48小時未檢測，應于_20°C以下保存，但不應超過30天。2、實驗前準備 實驗前需將所有試劑放置至室溫；準備好一次性平底試管和磁分離器及溫育時用于覆蓋磁分離器的塑料膜；調節水浴箱溫度為37°C;準備化學發光測定儀，并仔細閱讀儀器使用說明書。 3、試劑準備 實驗前將試劑盒中各試劑置混勻儀上充分混勻；磁微粒試劑混勻后應為均勻懸濁液，無明顯凝集。4、利用上述檢測CA50的化學發光免疫分析試劑盒檢測樣品。本專利技術的檢測方法如下 (1)加樣與免疫反應在每一平底試管中加入30μ I CA50校準品(質控品或待測樣本)；60 μ I抗試劑，混勻后，37°C溫育30分鐘；加入30 μ I磁微粒試劑，混勻后，37°C溫育5分鐘； (2)洗滌將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；每管中加入300 μ I清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；重復兩次； (3)加入發光底物溶液每個試管加入200μ I發光底物； (4)讀取發光值用化學發光儀測定每管的發光值； (5)如遇到高值HOOK樣本，為了避免出現高值HOOK效應，建議臨床醫師根據其余指標選擇合適的稀釋倍數對樣品進行稀釋。本專利技術具有以下優點 I、使用磁珠為固相，使免疫反應更接近液相，反應更充分和迅速，而且使結合的免疫復合物更加容易分離，降低了非特異性吸附。2、使用的抗試劑為單克隆抗體混合物，使免疫反應的親和力更高，而且單抗的生產批間差異相對小，更容易保證產品的批間穩定。3、使用化學發光底物溶液，使檢測的靈敏度得到了提高，而且線性范圍更寬。4、本方法的建立可以為其他試劑盒的開發提供一種方便、高靈敏度、準確性和穩定性的免疫檢測方法。本專利技術的主要創新之處在于 I、本專利技術試劑盒將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，本專利技術試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數。2、試劑盒中的磁微粒試劑、抗試劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、發光底物溶液及樣本稀釋液是該反應體系下的最優配方，給試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。本專利技術的檢測CA50的磁微粒化學發光免疫分析試劑盒主要采用直接夾心法定量檢測人血清等樣品中CA50的含量；對樣品的前處理要求低，前處理過程簡單，能快速、高通量檢測大批樣品；采用了高特異的單克隆抗體和超順磁、高分散、比表面積大的磁微粒子，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本專利技術的磁微粒化學發光免疫分析試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利，與市場上的酶聯免疫試劑盒等相比，線性范圍寬，有效避免鉤狀效應，不需樣品稀釋，適用于大批量樣品篩選的定量。附圖說明圖I為本專利技術的CA50化學發光免疫檢測標準曲線，其中，橫坐標為CA50的濃度， 縱坐標為相對發光強度(RLU)。具體實施例方式實施例I 一、磁珠緩沖液配制操作規程以配制IL為例 1、根據配制量，選擇合適容器，加入700ml的純水； 2、稱取Tris6. 02g, NaN3 O. 99g于容器中，混勻，室溫攪拌2小時； 3、檢測溶液？!1，應在10左右； 4、調制pH值為8.0； 5、量取Tween-202.76ml ;稱取硫酸新霉素O. 99g;四環素O. 03g ;BSA 4. 97g于容器中，攪拌I小時，調pH值至8. 0±0. 05; 6、定容至1L，調pH值至8.0±0. 05 ; 7、用O.22um濾器過濾，貯存于4°C。二、磁微粒試劑的制備過程 將直徑為O. I微米的四氧化三鐵微球用戊二醛進行活化，室溫混勻4小時后，用O. 01mol/L PBS pH7. 4緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50-100mg/ml ;然后，每毫升懸液中加入羊抗FITC抗體100 μ g，于37°C混勻溫育3-8小時；用等體積的O. Olmol/L PBS 5%BSA ρΗ7· 4 緩沖液于 37°C封閉 40 分鐘；最后，用 O. 5%BSA O. 02mol/L Tris-HClpH8. O緩沖液清洗三次，并用上述磁珠緩沖液配制一定濃度的工作液。實施例2 一、堿性磷酸酶AP與抗CA50單克隆抗體的偶聯 抗體為免疫球蛋白，含有氨基(-NH2),使用SMCC活本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人腫瘤標志物糖類抗原50即CA50的磁微粒化學發光免疫檢測方法，其特征在于：將羊抗FITC抗體與直徑為0.1？5微米的磁微粒連接組成固相試劑，經捕捉反應體系中的FITC標記抗體、抗原以及酶標記抗體后形成固相？FITC標記抗體？抗原？酶標記抗體夾心復合物；所述的酶標記抗體中使用的酶是堿性磷酸酶AP；所述的酶標試劑的偶聯方法是將N？琥珀酰胺3？（2？吡啶二巰基）丙酸SPDP活化的抗體與Traunt’s試劑活化的堿性磷酸酶以1:0.5？2的比例混合，并用凝膠層析柱分離純化；所使用的底物溶液為環二氧乙烷類衍生物AMPPD。
【技術特征摘要】
1.一種人腫瘤標志物糖類抗原50即CA50的磁微粒化學發光免疫檢測方法，其特征在于將羊抗FITC抗體與直徑為O. 1-5微米的磁微粒連接組成固相試劑，經捕捉反應體系中的FITC標記抗體、抗原以及酶標記抗體后形成固相-FITC標記抗體-抗原-酶標記抗體夾心復合物；所述的酶標記抗體中使用的酶是堿性磷酸酶AP ;所述的酶標試劑的偶聯方法是將N-琥珀酰胺3- (2-吡啶二巰基)丙酸SPDP活化的抗體與Traunt ’ s試劑活化的堿性磷酸酶以1:0. 5-2的比例混合，并用凝膠層析柱分離純化；所使用的底物溶液為環二氧乙烷類衍生物AMPPD。2.如權利要求I所述的CA50磁微粒化學發光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括磁微粒試劑；CA50校準品；CA50質控品；CA50抗試劑；清洗濃縮液；發光底物溶液；樣本稀釋液； 所述的磁微粒試劑為連接羊抗FITC抗體的磁微粒溶液； 所述的校準品及質控品為含有一定量CA50抗原的BSA緩沖液； 所述的抗試劑是由堿性磷酸酶AP標記的CA50單克隆抗體及異硫氰酸熒光素FITC標記的CA50單克...
【專利技術屬性】
技術研發人員：汪丹，丁建華，
申請(專利權)人：江陰澤成生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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