?本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種人甲狀腺球蛋白抗體（TGAb）的磁微粒化學發(fā)光免疫檢測方法，屬于免疫檢測分析技術(shù)領(lǐng)域。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的TG抗原和堿性磷酸酶（AP）標記的人IgG抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標二抗的夾心免疫復合物，類似“三明治”結(jié)構(gòu)。隨后加入連有抗FITC抗體的磁性微粒，通過抗FITC抗體與FITC的特異性結(jié)合使抗原抗體復合物連接在磁顆粒上，在外加磁場中直接沉淀，不需離心即可將免疫反應形成的復合物與未結(jié)合的其它物質(zhì)分離。本發(fā)明專利技術(shù)試劑盒將化學發(fā)光與磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明專利技術(shù)試劑盒具有更高的靈敏度、線性范圍寬、快速等諸多優(yōu)點，并且大大降低了產(chǎn)品成本，在臨床檢驗等方面具有廣闊的應用前景。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于免疫檢測分析
，涉及檢測血清中人甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)含量的磁微粒化學發(fā)光免疫分析試劑盒及其測試方法
技術(shù)介紹
甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin,TG)是甲狀腺濾泡柱狀細胞內(nèi)的一種糖蛋白，分子量為660KD，在甲狀腺激素的合成、儲存中有重要作用。在體內(nèi)，甲狀腺球 蛋白以膠質(zhì)形式包含著T3和T4，儲存在濾泡腔內(nèi)，在酶的作用下，T3和T4游離到細胞漿內(nèi)進入血液循環(huán)。 同時少量的TG也釋放入血，正常人也能檢測到TG，濃度為3-40ug/l。但當甲狀腺因病理原因受損，大量的TG釋放進入血液中，TG作為自身抗原，誘發(fā)產(chǎn)生抗TG抗體(TGAb)。TGAb作為甲狀腺球蛋白的自身抗體，在自身免疫性甲狀腺疾病(如有橋本甲狀腺炎、Graves病)中有較高陽性率如在甲狀腺炎出現(xiàn)頻率約80%，Graves病TGAB的陽性率約為 60%( Rosenbaum D and Davies TF., 1992; Nordyke RA et al. , 1993; Jean Ruf etal. , 1994)，在其他甲狀腺疾病及健康人群血清中亦可檢出，但滴度較低。所以臨床上，甲狀腺球蛋白抗體的定量檢測對甲狀腺疾病的診斷治療有重要意義(Feldt-Rasmussen U.，1996)。另外，甲狀腺癌與TGAb呈一定的相關(guān)性，TGAb值的升高是腫瘤惡化的一種標志(Schaadt B. et al. ,1995)。化學發(fā)光免疫檢測技術(shù)于上個世紀80年代，繼酶聯(lián)免疫技術(shù)和放免技術(shù)之后發(fā)展起來的新興技術(shù)，相對于后兩者化學發(fā)光免疫技術(shù)具有高靈敏度、高特異性，操作簡便、快速，標記結(jié)合物穩(wěn)定，同時無放射性同位素損傷和污染等特點，因此近年來在臨床檢測分析中被廣泛推廣使用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)需要解決的技術(shù)問題在于提供一種人甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)定量測定試劑盒及其檢測方法，采用該試劑盒進行TGAb檢測具有較高的靈敏度和特異性，操作更簡便，檢測時間更短。本專利技術(shù)提供了檢測TGAb化學發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括磁微粒試劑；TGAb校準品；TGAb質(zhì)控品；TGAb抗試劑A ;TGAb抗試劑B ;清洗濃縮液；發(fā)光底物溶液；樣本稀釋液。所述的磁微粒試劑為連接羊抗FITC抗體的磁微粒溶液； 所述的校準品及質(zhì)控品為含有一定量TGAb的BSA緩沖液； 所述的試劑A為含有一定量異硫氰酸熒光素(FITC)標記的TG抗原溶液； 所述的試劑B即二抗酶標試劑，是堿性磷酸酶(AP)標記的人IgG抗體的混合物； 所述的清洗濃縮液是含有Tris、NaCl和表面活性劑等的緩沖液； 所述的發(fā)光底物溶液是含Lumigen APS-5發(fā)光液的緩沖液；所述的樣本稀釋液是含有BSA的溶液。本專利技術(shù)所提供的檢測TGAb的樣品前處理方法，包括以下步驟 I、樣品前處理 對臨床血清，3000rpm離心5分鐘，取上層液即可進行分析測定。待測樣品2_8°C存放不得超過48小時，若48小時未檢測，應于_20°C以下保存，但不應超過30天。2、實驗前準備 實驗前需將所有試劑放置至室溫；準備好一次性平底試管和磁分離器及溫育時用于覆蓋磁分離器的塑料膜；調(diào)節(jié)水浴箱溫度為37°C;準備化學發(fā)光測定儀，并仔細閱讀儀器使用說明書。 3、試劑準備 實驗前將試劑盒中各試劑在置混勻儀上充分混勻；磁微粒試劑混勻后應為均勻懸濁液，無明顯凝集。4、利用上述檢測TGAb的化學發(fā)光免疫分析試劑盒檢測樣品。本專利技術(shù)的檢測方法如下 (1)加樣與免疫反應在每一平底試管中加入15μ I TGAb校準品、質(zhì)控品或待測樣本(預先用樣本稀釋液進行1:20-100稀釋)；30μ I試劑Α，混勻后，37°C溫育30分鐘；加入30 μ I磁微粒試劑，混勻后，37°C溫育15分鐘； (2)洗滌將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；每管中加入300 μ I清洗液，混勻后，將平底試管在磁分離器上靜置2分鐘，然后弧線傾倒上清液，將試管及磁分離器一同倒置在吸水紙上拍干；重復兩次； (3)加入二抗酶標試劑在每一平底試管中加入60μ I試劑B，混勻后，37°C溫育30分鐘； (4)洗滌同(2)步驟; (5)加入發(fā)光底物溶液每個試管加入200μ I發(fā)光底物； (6)讀取發(fā)光值用化學發(fā)光儀測定每管的發(fā)光值。本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點 I、使用磁珠為固相，使免疫反應更接近液相，反應更充分和迅速，而且使結(jié)合的免疫復合物更加容易分離，降低了非特異性吸附。2、使用的試劑B為單克隆抗體混合物，使免疫反應的親和力更高，而且單抗的生產(chǎn)批間差異相對小，更容易保證產(chǎn)品的批間穩(wěn)定。3、使用化學發(fā)光底物溶液，使檢測的靈敏度得到了提高，而且線性范圍更寬。4、本方法的建立可以為其他試劑盒的開發(fā)提供一種方便、高靈敏度、準確性和穩(wěn)定性的免疫檢測方法。本專利技術(shù)的主要創(chuàng)新之處在于 I、本專利技術(shù)試劑盒將化學發(fā)光技術(shù)與免疫磁微粒相結(jié)合，提供了一種接近均相的反應體系，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)試劑盒具有更高的檢測靈敏度和特異性，并達到了較佳的性能參數(shù)。2、試劑盒中的磁微粒試劑、試劑Α、試劑B、校準品、質(zhì)控品、清洗濃縮液、發(fā)光底物溶液及樣本稀釋液是該反應體系下的最優(yōu)配方，給試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。本專利技術(shù)的檢測TGAb的磁微粒化學發(fā)光免疫分析試劑盒主要采用間接法定量檢測人血清等樣品中TGAb的含量；對樣品的前處理要求低，前處理過程簡單，能快速、高通量檢測大批樣品；采用了高特異的單克隆抗體和超順磁、高分散、比表面積大的磁微粒子，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本專利技術(shù)的磁微粒化學發(fā)光免 疫分析試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利，與市場上的酶聯(lián)免疫試劑盒等相比，線性范圍寬，有效避免鉤狀效應，不需樣品稀釋，適用于大批量樣品篩選的定量。附圖說明圖I為本專利技術(shù)的TGAb化學發(fā)光免疫檢測標準曲線，其中，橫坐標為TGAb的濃度，縱坐標為相對發(fā)光強度(RLU)。具體實施例方式實施例I 一、磁珠緩沖液配制操作規(guī)程以配制IL為例 1、根據(jù)配制量，選擇合適容器，加入700ml的純水； 2、稱取Tris6. 02g, NaN3 O. 99g于容器中，混勻，室溫攪拌2小時； 3、檢測溶液？!1，應在10左右； 4、調(diào)制pH值為8.0； 5、量取Tween-202.76ml ;稱取硫酸新霉素O. 99g;四環(huán)素O. 03g ;BSA 4. 97g于容器中，攪拌I小時，調(diào)pH值至8. 0±0. 05; 6、定容至1L，調(diào)pH值至8.0±0. 05 ; 7、用O.22um濾器過濾，貯存于4°C。二、磁微粒試劑的制備過程 將直徑為O. I微米的四氧化三鐵微球用戊二醛進行活化，室溫混勻4小時后，用O. 01mol/L PBS pH7. 4緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50-100mg/ml ;然后，每毫升懸液中加入羊抗FITC抗體100 μ g，于37°C混勻溫育3-8小時；用等體積的O. Olmol/L PBS 5%BSA ρΗ7· 4 緩沖液于 37°C封閉 40 分鐘；最后，用 O. 5%BSA 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種人甲狀腺球蛋白抗體TGAb的磁微粒化學發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于：將羊抗FITC抗體與直徑為0.1？5微米的磁微粒連接組成固相試劑，經(jīng)捕捉反應體系中的FITC標記抗原、人甲狀腺球蛋白抗體以及二抗酶標記試劑后形成固相？抗原？抗體？酶標二抗夾心復合物；所述的二抗酶標抗體中使用的酶是堿性磷酸酶AP；所述的二抗酶標試劑的偶聯(lián)方法是將N？琥珀酰胺3？（2？吡啶二巰基）丙酸活化的抗體與Traunt’s試劑活化的堿性磷酸酶以1:0.5？2的比例混合，并用凝膠層析柱分離純化；所使用的底物溶液為環(huán)二氧乙烷類衍生物。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種人甲狀腺球蛋白抗體TGAb的磁微粒化學發(fā)光免疫檢測方法，其特征在于將羊抗FITC抗體與直徑為O. 1-5微米的磁微粒連接組成固相試劑，經(jīng)捕捉反應體系中的FITC標記抗原、人甲狀腺球蛋白抗體以及二抗酶標記試劑后形成固相-抗原-抗體-酶標二抗夾心復合物；所述的二抗酶標抗體中使用的酶是堿性磷酸酶AP ;所述的二抗酶標試劑的偶聯(lián)方法是將N-琥珀酰胺3- (2-吡啶二巰基)丙酸活化的抗體與Traunt’ s試劑活化的堿性磷酸酶以1:0. 5-2的比例混合，并用凝膠層析柱分離純化；所使用的底物溶液為環(huán)二氧乙烷類衍生物。2.如權(quán)利要求I所述的TGAb磁微粒化學發(fā)光免疫分析試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括磁微粒試劑；TGAb校準品；TGAb質(zhì)控品；TGAb試劑A ；TGAb試劑B ;清洗濃縮液；發(fā)光底物溶液；樣本稀釋液； 所述的磁微粒試劑為連接羊抗FITC抗體的磁微粒溶液； 所述的校準品及質(zhì)控品為含有一定量TGAb的BSA緩沖液； 所述的試劑A為含有一定量FITC標記的TG抗原溶液； 所述的試劑B即二抗酶標試劑，是堿性磷酸酶AP標記的人IgG抗體的混合物；...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：汪丹，丁建華，
申請(專利權(quán))人：江陰澤成生物技術(shù)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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