本發明專利技術公開了一種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，提供一種靈敏度高、特異性強、快速定量的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法。取殼聚糖溶液滴滿玻碳電極表面，于45℃干燥3h；冷卻至室溫，浸于NaOH溶液中，用超純水清洗掉NaOH溶液，浸于超純水中；取出自然晾干后置于納米金溶膠中；將納米金電極置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中自組裝；再取硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于單層納米金修飾電極表面的中心，干燥后，用超純水清洗；置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中自組裝，超純水沖洗后再置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中自組裝，置于牛血清白蛋白溶液中溫育，清洗未結合的牛血清白蛋白，自然晾干。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物免疫檢測
，特別是涉及。
技術介紹
食品與人類的生存和健康密切相關，保證食品的安全衛生、防止有毒有害物質通過食品對人體造成危害是至關重要的。臘樣芽胞桿菌是一種食源性致病菌，要求在所有的食品中不得檢出。 目前，臘樣芽胞桿菌的測定方法主要是通過增菌培養，然后再通過平板計數等方法測定，或者通過試劑盒測定，不僅用時長、靈敏度低，而且只能實現半定量。為了判斷食品是否安全，預防和控制食源性傳染病的傳播以及快速診斷出臘樣芽胞桿菌的存在，研制出一種靈敏度高、特異性強、快速定量的檢測方法是保障食品安全的重要手段。
技術實現思路
本專利技術的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，提供一種靈敏度高、特異性強、快速定量的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法。為實現本專利技術的目的所采用的技術方案是，包括下述步驟( I)將玻碳電極預處理后，取質量百分比濃度為O. 5%的殼聚糖溶液滴滿處理后的玻碳電極表面，于45°C干燥3h使所述殼聚糖溶液形成包住玻碳電極的凝膠；(2)干燥后自然冷卻至室溫,再浸于濃度為lmol/L的NaOH溶液中5min,用超純水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超純水中30min使NaOH離子徹底進入水中；加入NaOH的目的是催化聚膠，所以聚膠后需要徹底去掉；(3)取出自然晾干后置于納米金溶膠中至少24h，得到納米金電極；(4)將步驟(3)得到的納米金電極置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝至少24h，即得單層納米金修飾電極；(5)再取硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于上述單層納米金修飾電極表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超純水反復清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下無吸光值；然后置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中4°C自組裝至少24h，之后，超純水沖洗后再置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4°C自組裝至少24h，最后置于濃度為lg/1OOmL的牛血清白蛋白溶液中37°C溫育至少lh，以封閉非特異性位點，以含體積百分比為O. 05%Tween-20的磷酸緩沖液清洗未結合的牛血清白蛋白，自然晾干即得雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器。所述玻碳電極預處理包括下述過程將玻碳電極依次分別用Ι.ΟμπκΟ. 3μηι、O. 05 μ m粒徑的a -Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用HNO3與H2O按照體積比為I : I配置的混合液、無水乙醇、超純水清洗；在lmol/LH2SO4溶液中用掃描范圍為I. O 一 I. 0V、掃描速度為100mV/S的循環伏安法活化電極，重復掃描直至出現穩定的循環伏安曲線。所述納米金溶膠通過下述方法得到①制備納米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水沖洗掉殘留的酸液，再用蒸餾水浸泡24h，取出干燥后用含體積百分比為5% 二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，之后用超純水充分沖洗，烘干備用；②根據Frens法取濃度為O. O lg/1OOmL的氯金·酸溶液IOOmL,加入濃度為lg/1OOmL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，用HCl或K2CO3調節反應液pH值至7. 0，置于微波爐中低火保持18min，自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存備用。所述納米金/辣根過氧化物酶溶液采用下述方法制備用O. IM K2CO3調節所述納米金溶膠的pH值至7. O后，取ImL上述pH值為7. O的納米金溶膠與lmL2. Og/L辣根過氧化物酶溶液攪拌2h混勻，4°C靜置過夜。所述硫堇/殼聚糖共聚物溶液通過下述方法制備將2. 5mL質量體積百分比為2%的殼聚糖溶液加到320 μ L體積百分比為10%的戊二醛溶液中，混勻后加入0. OlM硫堇溶液200 μ L，最后加入體積百分比為2%的醋酸溶液至總體積為6mL，混勻后即可用于滴涂電極。所述純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體通過下述方法制備蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體腹水，采用蛋白A進行親和層析純化；腹水效價為I : 102400，抗體亞型為I gGl，對蘇云金芽孢桿菌I. 1014、蕈狀芽孢桿菌I. 0856、巨大芽孢桿菌I. 0151均無交叉反應。所述王水由濃HC I與濃HNO3按照體積比為3 I的比例配置而成。利用分光光度計對所制備的納米金溶膠在可見光范圍內進行掃描，光吸收性膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長λ max在510 550nm波長范圍內隨膠體金顆粒大小而變化，據此可通過最大吸收峰處波長對所制備納米金溶膠顆粒的大小進行粗略的表征；用透射電鏡對所制納米金溶膠顆粒的大小、形狀及分散情況進行進一步精確的表征。所述2. 0g/L辣根過氧化物酶液的制備方法為將0. 02g辣根過氧化物酶溶于O. OlM pH值為7. 4的磷酸緩沖液中。與現有技術相比，本專利技術的有益效果是本專利技術的方法以殼聚糖為橋聯劑固定第一層納米金于玻碳電極并吸附固定抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體；以滴電極方式將硫堇-殼聚糖/納米金-辣根過氧化物酶(HRP)復合物固定于上述電極，并吸附抗蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體構建了雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學免疫傳感器，靈敏度高，特異性強，能夠實現快速定量檢測。具體實施例方式以下結合具體實施例對本專利技術作進一步詳細說明。本專利技術的方法可以用于食源性臘樣芽胞桿菌檢測。以下以用于乳源的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法為實施例進行說明。實施例II、玻碳電極的預處理將玻碳電極依次分別用I. O μ m、O. 3 μ m、O. 05 μ m粒徑的a -Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用I : I的HNO3、無水乙醇、超純水清洗。在Imo l/L H2SO4溶液中用掃描范圍為I. O 一 I. 0V，掃描速度為100mV/S的循環伏安法活化電極，重復掃描直至出現穩定的循環伏安曲線。上述的穩定的循環伏安曲線滿足下述要求在實驗室條件下預處理后的電極的循環伏安曲線的峰電位差應在SOmV以下，并盡可能的接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環境中干燥待用。2、納米金(Nano-Au)溶膠的制備(I)制備納米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，所用王水由濃HC I與濃HNO3按照體積比為3 I混合而成。取出后用大量自來水沖洗殘留酸液，然后用蒸餾水浸泡24h。 (2)取出干燥后用含體積百分比為5% 二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液進行硅化，之后用超純水充分沖洗，烘干備用。(3)根據Frens法取O. O lg/1 OOmL氯金酸溶液IOOmL,加入lg/1 OOmL的檸檬酸鈉溶液4mL混勻，用HCl或K2CO3調節反應液pH值至7. 0，置于微波爐中低火保持18min，待其自然冷卻后用超純水補充至104mL即得納米金溶膠，置于4°C避光保存備用。利用分光光度計對所制備的納米金溶膠在可見光范圍內(400-700nm)進行掃描，光吸收性膠體金在可見光范圍內有一單一光吸收峰，且光吸收峰的波長入_在510 550nm波長范圍內隨膠體金顆粒大小而變化，據此可通過最大吸收峰處波長對所制備納米金溶膠顆粒的大小進行粗略的表征；結果應在518nm波長處有一很強的吸收峰，故可粗略確定納米金平均粒徑為15nm。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括下述步驟：（1）將玻碳電極預處理后，取質量百分比濃度為0.5%的殼聚糖溶液滴滿處理后的玻碳電極表面，于45℃干燥3h使所述殼聚糖溶液形成包住玻碳電極的凝膠；（2）干燥后自然冷卻至室溫，再浸于濃度為1mo？l/L的NaOH溶液中5min，用超純水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超純水中30min使NaOH離子徹底進入水中；（3）取出自然晾干后置于納米金溶膠中至少24h，得到納米金電極；（4）將步驟（3）得到的納米金電極置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4℃自組裝至少24h，即得單層納米金修飾電極；（5）再取硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于上述單層納米金修飾電極表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超純水反復清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下無吸光值；然后置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中4℃自組裝至少24h，之后，超純水沖洗后再置于純化的蠟樣芽孢桿菌單克隆抗體中4℃自組裝至少24h，最后置于濃度為1g/100mL的牛血清白蛋白溶液中37℃溫育至少1h，以封閉非特異性位點，以含體積百分比為0.05%Tween？20的磷酸緩沖液清洗未結合的牛血清白蛋白，自然晾干即得雙層納米金修飾的蠟樣芽孢桿菌電化學納米免疫傳感器。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：龐廣昌，康曉斌，陳慶森，梁新義，胡志和，
申請(專利權)人：天津商業大學，
類型：發明
國別省市：
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