D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條制造技術(shù)

本實(shí)用新型專利技術(shù)涉及一種D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條，在底襯上依次搭接地粘貼兩層樣品墊，結(jié)合墊，硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的結(jié)合墊上包被有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D-二聚體抗體A，所述的硝酸纖維素膜上包被有抗D-二聚體抗體B為檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線。本實(shí)用新型專利技術(shù)的試紙條能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)人血漿中D-二聚體含量，具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。（*該技術(shù)在2022年保護(hù)過(guò)期，可自由使用*）

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本技術(shù)屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條。
技術(shù)介紹
D-二聚體是血液中的纖維蛋白原受凝血酶等作用而凝固形成的聚合物，是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物。在生理狀態(tài)下，人體正常D- 二聚體的水平一般在200 μ g/L以下，機(jī)體保持著凝血與纖溶動(dòng)態(tài)平衡，以保證纖維蛋白及時(shí)形成和清除。如果這一平衡遭到破壞，血管內(nèi)凝血傾向增強(qiáng)，纖維蛋白聚集，纖維蛋白降解產(chǎn)物增加，D-二聚體含量增力口。因此，D-二聚體水平的升高反映體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)的雙重激活，可作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。D- 二聚體含量升高可檢測(cè)多種疾病的病程，如深靜脈血 栓(DVT)、彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)、心肌梗死、重癥肝炎、肺栓塞(PE)等疾病。因此血液中D-二聚體含量檢測(cè)有助于血栓前狀態(tài)及血栓形成性疾病的診斷，療效觀察及預(yù)后判斷。目前，D-二聚體檢測(cè)方法主要有乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、熒光抗體檢測(cè)法、免疫金標(biāo)法和膠乳免疫比濁法等。膠乳凝集法只能定性檢測(cè)，不能測(cè)定血漿中D-二聚體含量的變化。酶聯(lián)免疫法操作容易受到酶活性變化的影響，結(jié)果不太準(zhǔn)確。免疫膠體金法容易受類風(fēng)濕因子、肝素及血脂的影響，結(jié)果準(zhǔn)確性差。膠乳比濁法反應(yīng)特異性不好，所需試劑比較復(fù)雜。基于熒光標(biāo)記技術(shù)的免疫層析能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)樣品中D-二聚體的含量，同時(shí)靈敏度高。同時(shí)，本技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)試紙條結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，在原來(lái)樣品墊基礎(chǔ)上增加了一層樣品墊，有效過(guò)濾了樣品中殘余的血紅細(xì)胞，使得檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本技術(shù)的目的是提供一種操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低和能進(jìn)行定量檢測(cè)D- 二聚體的熒光免疫定量測(cè)定試紙條。本技術(shù)的技術(shù)方案為一種D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條，在底襯上依次搭接地粘貼兩層樣品墊，結(jié)合墊，硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的結(jié)合墊上包被有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D- 二聚體抗體A，所述的硝酸纖維素膜上包被有抗D- 二聚體抗體B為檢測(cè)線和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線。所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。所述的熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標(biāo)記的鏈霉親和素制備得到。所述熒光為直接熒光物質(zhì)，優(yōu)選異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。所述結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維素膜或聚酯膜。所述兩層樣品墊的材質(zhì)至少有一種是全血濾膜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本技術(shù)的試紙條能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)人血漿中D- 二聚體含量，具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低等特點(diǎn)。附圖說(shuō)明圖I為本技術(shù)D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為本技術(shù)實(shí)施例I所制備的試紙條的校準(zhǔn)曲線；圖3為本技術(shù)實(shí)施例I所制備的試紙條的線性范圍相關(guān)性；圖4為本技術(shù)實(shí)施例I所制備的試紙條與德國(guó)Siemens公司D- 二聚體試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較；其中，圖I :1、底襯；2、第一層樣品墊；3、第二層樣品墊；4、結(jié)合墊；5、硝酸纖維素膜；6、吸水紙；7、檢測(cè)線；8、質(zhì)控線。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本技術(shù)作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。D- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條，在底襯上依次搭接地樣品墊2、3，結(jié)合墊4，硝酸纖維素膜5和吸水紙6，所述結(jié)合墊4上噴涂有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D- 二聚體單克隆抗體Ml，所述硝酸纖維素膜5上有包被抗D- 二聚體單克隆抗體M2為檢測(cè)線7和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線8。以上抗體均購(gòu)自羅氏公司。上述硝酸纖維素膜上檢測(cè)7線還可以是包被抗D-二聚體的多克隆抗體，所述多克隆抗體是采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法免疫鼠獲得抗血清制備而得。進(jìn)一步所述的膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm。所述熒光為自發(fā)熒光物質(zhì)，優(yōu)選異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5中的一種。實(shí)施例ID- 二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條制備方法如下I)熒光膠乳微球的制備熒光膠乳微球的制備用吸附緩沖液(50mM、pH5. 8的檸檬酸鹽緩沖液)稀釋粒徑為IOOnm膠乳微球至終濃度20mg/ml,體積為5ml,制得膠乳微球懸浮液；添加適量的突光素Cy5標(biāo)記鏈霉親和素(購(gòu)自上海研晶生物科技有限公司)在吸附緩沖液里，終體積為5ml ;將上述膠乳微球懸浮液加入到上述含有熒光素標(biāo)記鏈霉親和素的吸附緩沖液中，制得混合液；將所得混合液在室溫下溫浴1-2小時(shí)，并不斷攪拌，然后離心，收集沉淀，沉淀用儲(chǔ)存緩沖液(含有O. 05%BSA的吸附緩沖液)溶解，放置4°C保存，備用。2)生物素化抗D- 二聚體抗體A的制備將抗D-二聚體單克隆抗體Ml用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液稀釋至lmg/ml,交互用O. lmol/L、pH8. O碳酸氫鈉緩沖液對(duì)D- 二聚體抗體Ml充分透析；用Iml DMSO溶解Img的NHSB，得到NHSB溶液；向上述ImlD- 二聚體單克隆抗體Ml溶液加入20 μ I NHSB溶液，室溫?cái)嚢?-4小時(shí)，繼續(xù)室溫?cái)嚢?0分鐘，然后用20mM、pH7. 2 PBS緩沖液透析，即得生物素化抗D- 二聚體單克隆抗體Ml。3)熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A的制備將步驟I)制得的熒光膠乳微球和步驟2)制得的生物素化D- 二聚體抗體Ml混合在一起，反應(yīng)30分鐘后離心，沉淀用用儲(chǔ)存緩沖液溶解，恢復(fù)至原體積。 4)包被熒光膠乳微球標(biāo)記D- 二聚體抗體A結(jié)合墊4的制備將步驟3)制得的熒光膠乳微球標(biāo)記抗D- 二聚體抗體Ml，按3. O μ 1/cm3的用量噴在玻璃纖維素膜4上。5)硝酸纖維素膜5的制備a)包被緩沖液的制備將O. 025M、pH7. 4的PBS，用O. 22 μ膜過(guò)濾，置于4°C備用，有效期7天。b)封閉液的制備將含1%BSA, 1%鹿糖，O. 025M、ρΗ7· 5的PBS,用O. 22 μ膜過(guò)濾， 置于4°C備用，有效期3天。c) D- 二聚體抗體檢測(cè)線7的制備將抗D- 二聚體單克隆抗體M2按2mg/ml的濃度，蠕動(dòng)泵授液量O. 4ml/min,劃線速度50m/20min，在干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí)。d)質(zhì)控線8的制備將兔抗鼠IgG抗體按8mg/ml的濃度，蠕動(dòng)泵授液量O. 4ml/min,劃線速度50m/20min，在硝酸纖維素膜5上劃線，該線與檢測(cè)線7平行，放入干燥箱內(nèi)20°C鼓風(fēng)干燥12小時(shí)。e)用上述封閉液將含有檢測(cè)線7和質(zhì)控線8的硝酸纖維素膜5于37°C封閉60分鐘，取出后置37°C下烘干處理兩個(gè)小時(shí)，封袋備用。6)試紙條組裝在底襯I上順次相互搭接地粘貼樣品墊2、3，玻璃纖維素膜4，硝酸纖維素膜5和吸水紙6得到試紙板，按照要求切割成適當(dāng)寬度的試紙條。實(shí)施例2另一種D-二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條制備方法如下I)突光膠乳微球的制備熒光膠乳微球的制備用吸附緩沖液(50mM、pH5. 8的檸檬酸鹽緩沖液)稀釋粒徑為400nm膠乳微球至終濃度30mg/ml,體積為6ml,制得膠乳微球懸浮液；添加適量的紅色熒光素羅丹明標(biāo)記鏈霉親和素(購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司)在吸附緩沖液里，終體積為6ml ;將上述膠乳微球懸浮液加入到上述含有紅色熒光素羅丹明標(biāo)記鏈霉親和素的吸附緩沖液中，制得混合液；將所得混合液在室溫下溫浴1-2小時(shí)，并不斷攪拌，然后離心本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種D？二聚體熒光免疫定量測(cè)定試紙條，在底襯（1）上依次搭接地粘貼樣品墊（2、3），結(jié)合墊（4），硝酸纖維素膜（5）和吸水紙（6），其特征在于所述的結(jié)合墊（4）上包被有熒光膠乳微球標(biāo)記的抗D？二聚體抗體A，所述的硝酸纖維素膜（5）上包被有抗D？二聚體抗體B為檢測(cè)線（7）和兔抗鼠IgG抗體作為質(zhì)控線（8）。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蘇恩本，黃力，陳偉，涂策，沈小娟，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京基蛋生物科技有限公司，
類型：實(shí)用新型
國(guó)別省市：