本發明專利技術提供了一種多肽及其制備方法和用途，該多肽為纈酪肽截斷后的片段，由其第3～25位的氨基酸殘基組成，其氨基酸序列如下：YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。本發明專利技術提供的多肽的制備方法如下：首先將耐熱腸多肽從豬腸道中提取出，然后從耐熱腸多肽中提取中粗肽，將粗肽溶于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的一份，將其凍干即得粗提取物，將粗提取物進行提純后即可制得上述多肽。本發明專利技術中還提供了上述多肽及其藥學上可接受的鹽的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種纈酪肽截短后的片段，該多肽片段具有刺激分泌胰島素的作用，本專利技術同時還提供了上述多肽片段的制備方法。
技術介紹
纈酪肽是ー種二十五肽，由二十五個氨基酸通過肽鍵連接而成，最初在豬小腸中分離而得，目前主要應用于治療消化系統的腫瘤中。糖尿病是ー種血液中的葡萄糖容易堆積過多的疾病。國外給它的別名為“沉默的殺手” (Silent Killer)，特別是〃成人型糖尿病〃。四十歲以上的中年人染患率特別高，在日本，四十歲以上的人口中發病率占10%，即十人當中就有一位糖尿病患者，一旦患上〃糖 是促進胰島素分泌的藥物和直接補充胰島素，但是這些藥物要么效果不好要么會產生胰島素抵抗性。所以尋找新的治療糖尿病的藥物一直在進行中。
技術實現思路
本專利技術提供了ー種多肽片段，經檢測后發現其為纈酪肽的截斷后的片段，由纈酪肽3 25位的氨基酸殘基組成，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。本專利技術同時還提供了如上所述的多肽在生物醫藥上被認可的經化學修飾后的多肽。本專利技術提供了上述多肽的制備方法，包括以下步驟(I)、將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡3 7分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在O 10° C條件下用醋酸對腸道進行浸取后過濾得浸出液，用鹽酸對浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽；(2)、將耐熱腸多肽溶解于水中，加入抗氧化劑及足量異丙醇溶液，室溫下充分靜置后離心除去沉淀，然后再加入足量溫度為-25で -15 °C的異丙醇溶液并在-25°C _15°C條件下充分靜置后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值調節為5. 8 6. 1，再在-25で -15°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀充分洗滌后即制得粗肽；(3)、將步驟(2)中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物；(4)、將粗提取物溶解于碳酸氫銨溶液中并攪拌，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過柱層析并采用PH值為8. O、濃度為O. 02mol/L的碳酸氫銨溶液進行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經過兩次高效液相色譜分離后，將分離物凍干即制得權利要求I所述氨基酸序列的多肽。步驟(I)中醋酸的濃度為O. 5mol/L，鹽酸的濃度為O. 2mol/L。步驟(2)中抗氧化劑為硫ニ甘醇，添加量為I. 2毫升；洗滌分兩次進行，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用こ醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環境中使こ醚在真空中蒸發。所述步驟(4)中的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸水溶液，第二次分離所用洗提液為O. I %的三氟こ酸的こ腈溶液。本專利技術同時還提供了上述多肽及其藥學上可接受的鹽的用途，用于制造刺激胰腺分泌胰島素的藥物。本專利技術提供的多肽以及其在生物醫藥上被認可的經修飾后的多肽，能夠有效的刺激胰腺細胞分泌胰島素，與目前的治療糖尿病藥物中采用最多的高糖相比，本專利技術提供的多肽的效果更明顯。附圖說明 圖I為本專利技術實施例I中的粗肽層析分離結果圖；圖2為本專利技術實施例I中第二次高效液相色譜分離結果圖；圖3為本專利技術提供的多肽的氨基酸序列圖；圖4為本專利技術提供的胰腺刺激試驗的實驗結果圖。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術做詳細具體的說明。實施例I本實施例中采用以下制備步驟(I)、取30千克新鮮豬腸，將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡4分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在5° C條件下用O. 5mol/L的醋酸對腸道進行浸取后過濾得浸出液，然后用O. 2mol/L的鹽酸對浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽約30克，耐熱腸多肽的產率約為豬腸濕重的O. 01%。(2)、將30克耐熱腸多肽溶解于O. 24L水中，加入I. 2毫升抗氧化劑硫ニ甘醇及I.08L異丙醇溶液，室溫下靜置2小時后離心除去沉淀，然后再加入I. 32L溫度為_20°C的異丙醇溶液并在_20°C條件下靜置24小時后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值用鹽酸調節為6，再在-20°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀分兩次進行洗滌，第一次洗滌選用異丙醇溶液，第二次洗滌選用こ醚溶液，第二次洗滌完成后將白色沉淀放入真空環境中使こ醚在真空中蒸發即制得粗肽6. 5克。(3)、將步驟(2)中制得的粗肽6. 5克溶解于300mL0. 2mol/L的醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物，如圖I所示，選取圖I中所標記的ー份為目標物。(4)、將粗提取物溶解于81. 5mL0. 01mol/L的碳酸氫銨溶液中并攪拌20分鐘，離心后去除沉淀得上清液，將所得上清液過柱層析并采用PH值為8. O、濃度為O. 02mol/L的碳酸氫銨溶液進行洗滌，洗滌后得到的洗滌物凍干，再將洗滌物經過兩次高效液相色譜分離后，所述的兩次高效液相色譜分離中，第一次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸水溶液；第二次分離所用洗提液為O. 1%的三氟こ酸的こ腈溶液，將第二次分離后所得沉淀收集并凍干即制得權利要求I所述氨基酸序列的多肽，如圖2所示，目標物即為本專利技術所提供的多肽。對上述步驟中制的多肽經SDS-PAGE膠純化。進行氨基酸測序用Edman降解法做肽序列分析。Applied Biosystems 477A儀器偶聯120 Aanalyzer、Milligen 6600> Waters 440分析儀,進行氨基酸序列分析。測序結果如圖3所示 多肽IYPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY 23與纈酪肽其序列為VQ YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY只有兩個氨基酸的差異。由此可知，本專利技術中的多肽為纈酪肽第3至第25氨基酸殘基所組成的多肽片段。對本專利技術中制得的多肽性能進行研究，測試在離體大鼠胰島灌流系統進行葡萄糖誘導的胰島素分泌的影響。雄性SD大鼠(體重200 250克)，經麻醉后取出胰腺，然后用膠原酶消化。上述胰腺在37°C下用RPMI 1640培養基培養過夜，所述的培養基中第一組添加有3. 3mM的葡萄糖，第二組中添加有16. 7mM的葡萄糖，第三組中添加有16. 7mM的葡萄糖和IOnM的纈酪肽3-25。用放射免疫分析法來確定三個胰腺所釋放的胰島素量。測定結果如圖4所示，由此可見纈酪肽3-25具有明顯的促胰島素分泌的作用。實施例2本實施例中采用以下制備步驟(I)、取20千克新鮮豬腸，將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡6分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在8° C條件下用O. 5mol/L的醋酸對腸道進行浸取后過濾得浸出液，然后用O. 2mol/L的鹽酸對浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽約19克，耐熱腸多肽的產率約為豬腸濕重的O. 01%。(2)、將19克耐熱腸多肽溶解于O. 15L水中，加入I毫升抗氧化劑硫ニ甘醇及O. 7L異丙醇溶液，室溫下靜置2小時后離心除去沉淀，然后再加入O. 89L溫度為_23°C的異丙醇溶液并在_20°C條件下靜置24小時后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值用鹽酸調節為6，再在-18°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀分兩次進行洗滌，第一次洗滌選用異丙本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種多肽，其氨基酸序列如下：YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。
【技術特征摘要】
1.一種多肽，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。2.如權利要求I所述的多肽在生物醫藥上被認可的經修飾的多肽，其氨基酸序列如下YPVEHPDKFLKFGMTPSKGVLFY。3.如權利要求I所述的多肽的制備方法，其特征在于采用以下步驟 (1)、將豬腸道洗浄后浸入沸水中浸泡3 7分鐘，浸泡完成后取出冷凍并剁碎，然后在O 10° C條件下用醋酸對腸道進行浸取后過濾得浸出液，用鹽酸對浸出液中的浸出物洗脫并抽濾得耐熱腸多肽； (2)、將耐熱腸多肽溶解于水中，加入抗氧化劑及足量異丙醇溶液，室溫下充分靜置后離心除去沉淀，然后再加入足量溫度為_25°C _15°C的異丙醇溶液并在-25°C _15°C條件下充分靜置后抽濾去除沉淀，將所得濾液的PH值調節為5. 8 6. 1，再在-25°C _15°C條件下充分靜置后抽濾得白色沉淀，將白色沉淀充分洗滌后即制得粗肽； (3)、將步驟(2)中制得的粗肽溶解于醋酸溶液中制得肽溶液，將肽溶液過柱層析分離得到分離物，選取分離物中具有刺激胰腺分泌胰島素功能的ー份，將其凍干即得粗提取物； (4)、將粗提取...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李臣鴻，汪俊漢，陳正望，
申請(專利權)人：中南民族大學，
類型：發明
國別省市：
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