一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法技術

本發明專利技術涉及一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，包括酪蛋白溶液的制備、4酶混合物調配、4酶混合水解、滅酶、離心除雜、調整酶解液活力、調味及制成產品幾個步驟，具體是：將酪蛋白與無菌水按質量比3:16混合調成糊狀，用氫氧化鈉溶液調至pH值為8~10，加熱使酪蛋白充分溶解，用食用鹽酸降低pH值為6~8；加入木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶組成的4酶混合物酶解酪蛋白；酶解完成之后滅活蛋白酶，冷卻至室溫；酶解液離心除雜后，用無菌水調節酶解液活力并加適量甜蜜素、檸檬酸制成產品；本方法工藝簡單易行，生產周期較短；制得的抗凝血肽口服產品抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價格低、安全可靠。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種酪蛋白抗凝血肽口服液，具體涉及一種利用4酶混合酶解酪蛋白制備抗凝血肽口服液的方法，屬于醫藥、保健食品生產

技術介紹
世界上心腦血管疾病的死亡率一直居于前二位，全世界每年死于該類疾病的人數超過1500萬，其中血栓栓塞性心腦血管疾病發病率和死亡率最高。據衛生部統計,我國每年死于心腦血管疾病約200萬人，超過全部死亡病人的50%。心腦血管疾病中有很大比例是血栓病,并以血栓病的發病率、致殘率和死亡率最高,其病因是血栓的形成。血栓性疾病治療的最有效辦法是溶栓治療，人類每年需要為該類疾病支出巨額藥費。 導致血管內血栓形成雖有多種因素，但凝血酶誘發的血液凝固是血栓形成的主要觸發機理。水蛭素是水蛭唾液腺內一類相對分子質量約7 000的多肽，是凝血酶的特效抑制劑，它主要通過靠近肽鏈C-端的由3 4個酸性氨基酸組成的活性部位與凝血酶富含堿性氨基酸的活性部位特異性結合。試驗結果表明，水蛭素既能防止新的血栓形成，還能使已形成的血栓溶解，對多種血栓疾病都具有極好的預防和治療作用。目前，有人嘗試使用水蛭素治療血栓栓塞性心腦血管疾病，發現口服給藥雖然方便，但因水蛭素被患者胃腸道水解，幾乎完全喪失了抗栓、溶栓的效果；雖然注射給藥療效很好，但反復注射會給患者帶來很大的痛苦和不便，難以適應大多數慢性高凝態患者長期抗凝治療的需要。而且水蛭飼養成本較高，高純度水蛭素提取工藝復雜、設備投入大，注射劑價格較高，患者承受的經濟壓力大。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白質，由a、P、Y和K酪蛋白組成，營養價值較高，經酸化或凝乳酶處理后沉淀分離、干燥而得。研究發現，酪蛋白分子內含有若干具有抗凝血酶活性的肽段，按生物化學理論，在蛋白酶的作用下，蛋白質被水解為肽段，在合適的工藝條件下水解酪蛋白，可使這些肽段釋放出來，從而獲得功能與水蛭素類似的抗凝血肽，但到目前為止尚無成功的報道，而且近年研究發現，2 3肽能被人體完全迅速吸收，4肽、5肽甚至6肽都能被動物直接吸收。本專利技術以酪蛋白為原料，以木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶構成的4酶混合水解系統進行水解，使酪蛋白中的抗凝血肽釋放出來，從而獲得富含抗凝血肽的酶解液。以此為主要原料，加上一些輔料制成抗凝血肽口服液。本專利技術開發出一種抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價格低、安全可靠的抗凝血肽口服產品，以消除血栓栓塞性心腦血管疾病患者痛苦。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供，制得的抗凝血肽口服產品抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價格低、安全可靠。為實現上述專利技術的目的，本專利技術采取的技術方案如下 ，包括以下幾個步驟(1)酪蛋白溶液的制備將酪蛋白與無菌水按3:16的比例調成糊狀，以300r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mo I L—1食用氫氧化鈉溶液調至pH值為8 10，至50°C停止加熱，保溫；當糊狀液體變得均勻、透明時，用2 mol .171食用鹽酸調至pH值為6 8，停止攪拌并在容器壁作好液面記號； (2)4酶混合物調配按每千克酪蛋白分別添加木瓜蛋白酶(80萬U/g) 8 12g、菠蘿蛋白酶(80萬U/g)l(T20g、中性蛋白酶(40萬U/g)10 15 g、堿性蛋白酶(40萬U/g) l(T20g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個不銹鋼容器內，用不銹鋼勺混合均勻，備用； (3)4酶混合水解在4酶混合物內加入相當于其3倍質量的50 °C無菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入上述已預熱至50 "€的酪蛋白溶液中，以300 r mirT1邊攪拌邊加熱并開始計時，維持酪蛋白溶液(50 ± I) V’酶解3 5h后，停止攪拌及加熱，往酪蛋白溶液中補加50°C無菌水至液面記號； (4)滅酶將酶解完畢的酪蛋白溶液迅速升溫至100°C保持1(T15 min后，停止加熱放 冷至室溫，加無菌水至液面記號攪拌均勻； (5)離心除雜將酪蛋白4酶混合水解液以10000 r ^irT1離心15 25 min，去除沉淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液； (6)調整酶解液活力將上述原液用無菌水調節至35(T360抗凝血酶活力單位(ATU) mL'得酪蛋白混合酶解液； (7)調味及制成產品將酪蛋白混合酶解液、甜蜜素、檸檬酸按質量以I000:0. ro. 3r3的比例混合，溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液原液。與現有的技術相比，本專利技術的突出實質性特點和顯著的進步是 (1)以4酶混合水解比單酶(ProteaseN)水解能顯著提高酶解效果，本專利技術3批酶解液3肽的質量分數平均98. 53%，提高了約27. 53% ;抗凝血酶活力平均413. 29 ATU mL—1 ；3批酶解液有關數據如下表I。表I 3批酶解液原液中3肽占水解物總量的比例以及抗凝血酶活力強度 廳解液序 3 K占水解_總量的庾量分 抗_血靡活力< ATUniL-) I號' I9S 7!429； I 25S.邛413 52 ! }9S4S415 64 卜翁9S—53丨4U—3I (2)在混合酶的作用下，酪蛋白被水解為肽段并釋放出來，從而獲得功能與水蛭素類似的抗凝血肽，可被人體直接吸收，抑制凝血酶的作用，防止血栓的形成，與現有技術相比，成本低，效果好，無副作用。(3)開發出了一種抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價格低、安全可靠的抗凝血肽口服產品,可以消除血栓栓塞性心腦血管疾病患者痛苦。具體實施方式下面通過實例對本專利技術做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本專利技術，并不限制本專利技術的范圍。實施例I I、按質量比將酪蛋白與無菌水以3:16的比例調成糊狀，以300 r mirT1攪拌，邊加熱邊加入2 mo I L—1食用氫氧化鈉溶液調至pH值為8，至50°C停止加熱，保溫。當糊狀液體變成均勻、透明的溶液后，用2 mol L—1食用鹽酸調至pH值為6，停止攪拌。2、根據以上酪蛋白質量，按每千克分別加木瓜蛋白酶(80萬U/g)8 g、菠蘿蛋白酶(80萬U/g) 10g、中性蛋白酶(40萬U/g) 10g、堿性蛋白酶(40萬U/g) IOg的比例,4種酶按需要量取出后，倒在同一個不銹鋼容器內，用不銹鋼勺混合均勻成為4酶混合物。按4酶混合物的質量加入3倍的50 °C無菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入上述已預熱至50 0C的酪蛋白溶液中，記錄液面位置。以300 r ^irT1邊攪拌邊加熱并開始記時，維持酪蛋白 溶液(50±1) °C，酶解3h后，停止攪拌及加熱，補加50 1無菌水至液面的記號。3、將酶解完畢的酪蛋白混合酶解液迅速升溫至100 °C保持10 min后，停止加熱放冷至室溫，加無菌水至液面的記號，攪拌均勻。4、將步驟3所得的酪蛋白酶混合酶解液以10 000 r mirT1離心15 min,去除沉淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液。5、測定酪蛋白混合酶解液原液ATU，用無菌水稀釋至350 ATU -mL'得酪蛋白混合酶解液。6、上述酪蛋白混合酶解液與甜蜜素、檸檬酸按質量以I 000:0. 1:1的比例混合，溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液。7、酪蛋白抗凝血肽口服液液分裝、滅菌、檢測。經實際測定，酪蛋白抗凝血肽口服液各項微生物指標符合中華人民共和國國家標準保健(功能)食品本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種酪蛋白抗凝血肽口服液的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：（1）酪蛋白溶液的制備：將酪蛋白與無菌水按比例調成糊狀，以300？r·min？1攪拌，邊加熱邊加入2？mol·L？1食用氫氧化鈉溶液調至pH值為8~10，至50℃停止加熱，保溫；當糊狀液體變得均勻、透明時，用2？mol·L？1食用鹽酸調至pH值為6~8，停止攪拌并在容器壁作好液面記號；（2）4酶混合物調配：按每千克酪蛋白分別添加木瓜蛋白酶8~12？g、菠蘿蛋白酶10~20g、中性蛋白酶10~15g、堿性蛋白酶15~20g的比例，4種酶按需要量取出后，倒在同一個不銹鋼容器內，用不銹鋼勺混合均勻，備用；（3）4酶混合水解：在4酶混合物內加入相當于其3倍質量的50℃無菌水，用不銹鋼勺混合均勻，倒入步驟（1）所述已預熱至50℃的酪蛋白溶液中，以300？r·min？1邊攪拌邊加熱并開始記時，維持酪蛋白溶液(50±1)？℃，酶解3~5？h后，停止攪拌及加熱，往酪蛋白溶液中補加50℃無菌水至液面記號；（4）滅酶：將酶解完畢的酪蛋白溶液迅速升溫至100？℃保持10~15？min后，停止加熱放冷至室溫，加無菌水至液面記號攪拌均勻；（5）離心除雜：將酪蛋白4酶混合水解液以10？000？r·min？1離心15~25？min，去除沉淀收集液相，得酪蛋白混合酶解液原液；（6）調整酶解液活力：步驟（6）所得原液用無菌水調節至350~360抗凝血酶活力單位（ATU）·mL？1，測定酪蛋白混合酶解液原液的ATU，得酪蛋白混合酶解液；（7）調味及制成產品：將酪蛋白混合酶解液、甜蜜素、檸檬酸按質量以1？000:0.1~0.3:1~3的比例混合，溶解、混合均勻，得酪蛋白抗凝血肽口服液原液。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：方富永，苗艷麗，王宏波，蘆志剛，廖艷，宋文東，
申請(專利權)人：廣東海洋大學，
類型：發明
國別省市：