本發明專利技術屬于傳染病防治領域，具體涉及用于阻斷惡性瘧疾傳播的疫苗的候選靶抗原。本發明專利技術采用基因重組手段，構建成惡性瘧原蟲pfs25蛋白二聚體衍生物，該二聚體衍生物包括被連接臂連接的兩個pfs25蛋白質單元。獲得的二聚體衍生物增強了pfs25蛋白的免疫原性，在動物體內能夠激發更高的抗體應答。該二聚體可被重組酵母細胞高表達產生，并分泌到培養基中。經純化，得到成分均一的表達產物，適合大規模生產。該惡性瘧原蟲pfs25蛋白二聚體衍生物有望成為惡性瘧傳播阻斷型疫苗的候選抗原。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于傳染病防治領域，具體涉及惡性瘧疾的防治，尤其涉及用于阻斷瘧疾傳播的疫苗的候選靶抗原。
技術介紹
瘧疾是通過按蚊叮咬傳播的寄生蟲病，其病原體為瘧原蟲。世界衛生組織2009年年度報告顯示，全球每年有2. 43億瘧疾臨床病例，死亡86. 3萬人(WHO. World MalariaReport 2009[EB/0L],)。鑒于此，針對死亡率甚高的惡性瘧疾開發預防用疫苗，已經成為與愛滋病、結核疫苗并列的世界“三大”疫苗項目之一。世界衛生組織、聯合國計劃開發署已將瘧疾疫苗列入優先發展項目。比爾·蓋茨基金會也設置了 “瘧疾疫苗專題”。 Pfs25蛋白是惡性瘧原蟲的配子體表面蛋白，并持續存在于合子和動合子期，Pfs25是介導動合子穿越圍食膜(peritrophic membrane, PM)和對蚊中腸壁基底膜侵入的關鍵性蛋白，其抗體能夠抑制合子在蚊蟲腸道內的發育，因此起到傳播阻斷的效果，所以pfs25蛋白被認為是惡性瘧疾疫苗的重要候選抗原。這種疫苗與其他瘧疾疫苗或抗瘧藥聯合應用時，可阻斷那些逃避疫苗保護或對藥物產生抗性而幸存下來原蟲的傳播。1988年Kaslow DC等首次報道了 Pfs25蛋白質，結果表明該蛋白質由217個氨基酸組成，富含半胱氨酸，其分子特征是存在四個“EGF樣的結構域”(Nature. 1988 May5;333(6168) :74-6. );1991年Barr PJ等報道了重組Pfs25蛋白作為傳播阻斷疫苗在試驗動物上的效果(The Journal of experimental medicine. 1991 Nov I ;174(5) : 1203-8.);以上研究為進一步研制傳播阻斷型惡性瘧疾疫苗奠定了基礎。此后，很多研究人員在多種系統中對pfs25進行了表達和評價,Takafumi Tsuboi等人在麥芽無細胞系統(Wheat GermCell-Free System)中表達了 Pfs25蛋白，該重組蛋白可抑制痕原蟲的發育(Infection andImmunity, 2008, 76 (4) : 1702-1708. ) ；Godfree Mlambo等在昆蟲桿狀病毒表達體系中表達了 Pfs25 蛋白(Vaccine 2010, 28:7025 - 7029) ；Christine E.等報道了 pfs25 在植物表達系統中表達，并且驗證了對惡性痕疾傳播的阻斷活性(Human Vaccines, 2011, Volume 7Supplement, DOI: 10. 4161/hv. 7. 0. 14588.)。在各種表達體系中，酵母表達體系被廣泛應用，獲得的表達產物也被應用于人體臨床研究。1993年，Kaslow DC等公開了采用酵母系統表達Pfs25蛋白突變體的方法，該突變體將pfs25蛋白天然序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換成丙氨酸(美國專利US5217898) ；Zou L等報道在畢赤酵母中表達的另一種pfs25蛋白突變體，該突變體將Pfs25蛋白天然序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換成谷氨酰胺(Vaccine. 2003Apr2; 21 (15) :1650-7.)。在以上工作的基礎上，Yimin Wu等人分別將酵母重組的Pfs25蛋白突變體(Zou L 等，Vaccine. 2003Apr 2; 21 (15) : 1650-7.)和與 Montanide ISA 51 佐劑混合制作疫苗進行了 I期臨床試驗，該項目試驗的結果表明，pfs25蛋白質在人體內能夠激發免疫應答，但是，血清抗體效價較低，維持時間短暫，參見PloS one. 2008; 3 (7) :e2636.的公開。作為候選疫苗而言，pfs25蛋白質的免疫原性較弱，有待于進一步增強。Feng Qian等通過把pfs25蛋白與綠膿桿菌外毒素A (ExoProtein A)偶聯，明顯提高了 pfs25蛋白的免疫原性，參見 Vaccine. 2007; 25 (20) :3923 - 3933 的公開。Joanna Kubler-Kielb 等以卵清蛋白(0VA)、環子孢子蛋白(CSP)及pfs25蛋白自身作為載體蛋白，得到系列pfs25蛋白和載體蛋白偶聯物，可以提升Pfs25蛋白的免疫原性并維持較長時間的免疫應答，具體參見 PNAS. 2007; 104(1) :293-298 的公開。上述研究工作，都采用化學試劑在蛋白質水平進行偶聯，雖然pfs25的免疫原性得到了增強，但是其缺陷在于pfs25蛋白-載體偶聯物結構不確定、偶聯效率低、生產工藝復雜，從而增加了生產過程中質控的難度。因此，本領域迫切需要研制新類型的Pfs25衍生抗原，用于防治瘧疾。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種新的惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物，作為傳播阻斷疫苗的候選抗原，以解決Pfs25蛋白免疫原性弱的問題。本專利技術的第一方面，提供了一種惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物，具體而言，該衍生物是基因重組的Pfs25蛋白二聚體，具有如下結構pfs25-L-pfs25其中pfs25代表pfs25蛋白突變體，L代表連接臂(linker)。所述的pfs25蛋白突變體包括相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸片段及其非糖基化突變體，即去除了 Pfs25天然序列N端22個氨基酸的信號肽序列和C端的24個氨基酸的膜結合區域，和/或對相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺進行點突變。在一個優選的方案中，所述的pfs25蛋白突變體包含相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替換為丙氨酸。在一個優選的方案中，所述的pfs25蛋白突變體包含相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺。在一個優選的方案中，所述的pfs25蛋白突變體包含相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸序列，但其中相當于天然序列第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酸。所述的連接臂由甘氨酸、絲氨酸組成，具有如下結構Sa_(GbS)。，其中S代表絲氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4，c=l-4的整數。在一個優選的方案中，連接臂具有SGGGGS的結構。在一個優選的方案中，連接臂具有(GGGGS)3的結構。在一個優選的方案中，連接臂具有(GGGS)4的結構在更優選的方案中，惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物具有序列表Seq. No. 5所示的氨基酸序列。在在更優選的方案中，惡性瘧原蟲Pfs25蛋白衍生物具有序列表Seq. No. 7所示的氨基酸序列。本專利技術的第二方面，提供了惡性瘧原蟲Pfs25蛋白二聚體衍生物的用途，用于制備預防惡性瘧的傳播阻斷疫苗。本專利技術的(pfs25)2蛋白衍生物，分子結構上是由多肽連接臂連接的兩個pfs25蛋白亞基形成二聚體，多肽連接臂對兩個Pfs25蛋白亞基的生物活性沒有影響，保持了 pfs25蛋白自身的性質。本研究的數據顯示，(pfs25) 2蛋白可以和抗pfs25的標準單抗4B7特異反應，這反映了(pf s25) 2分子保留了 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種惡性瘧原蟲Pfs25蛋白的二聚體衍生物，具有如下結構：pfs25？L？pfs25其中pfs25代表pfs25蛋白突變體，L代表連接臂（linker）；所述的pfs25蛋白突變體包括相當于pfs25蛋白天然序列的23？193位氨基酸片段及其非糖基化突變體；所述的連接臂具有如下結構：Sa？(GbS)c，其中S代表絲氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4，c=1？4的整數。
【技術特征摘要】
1.一種惡性瘧原蟲Pfs25蛋白的二聚體衍生物，具有如下結構pfs25_L_pfs25 其中pfs25代表pfs25蛋白突變體，L代表連接臂(linker)； 所述的pfs25蛋白突變體包括相當于pfs25蛋白天然序列的23-193位氨基酸片段及其非糖基化突變體； 所述的連接臂具有如下結構Sa_(GbS)。，其中S代表絲氨酸，G代表甘氨酸，a=0或1，b=3或4, c=l-4的整數。2.根據權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突變體相當于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換為丙氨酸。3.根據權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于，所述的pfs25蛋白突變體相當于天然Pfs25序列的第112、165、187位的天冬酰胺替換為谷氨酰胺。4.根據權利要求I的Pfs25蛋白的二聚體衍生物，其特征在于...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳勇，蔣琳，高雪峰，雷清，楊軍，李剛，
申請(專利權)人：蘭州生物制品研究所有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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