一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法技術

本發明專利技術生物酶合成技術領域，特別是涉及一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L?蘋果酸的方法。本發明專利技術要解決的技術問題是富馬酸酶提取的產率低、成本高。本發明專利技術的技術方案是一種利用重組大腸桿菌合成L?蘋果酸的方法，具體如下：構建表達富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌，液體培養工程菌，加入反應底物富馬酸鈉，全細胞催化直至反應完全，收集反應液。本申請利用分子生物學技術，通過重組大腸桿菌全細胞，以富馬酸鈉為轉化底物生產L?蘋果酸。本發明專利技術方法中L?蘋果酸的產率可達到95％。本發明專利技術為提高蘋果酸產量的研究提供方向，同時也為其他有機酸的研究奠定基礎。

【技術實現步驟摘要】
一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法
本專利技術生物酶合成
，特別是涉及一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法。
技術介紹
蘋果酸別名2-羥基丁二酸，是一種十分常見卻又十分重要的天然有機酸，其電離常數K1為4.0×10-4、K2為9×10-6，是生物體內三羧酸循環成員之一。分子內含有一個不對稱碳原子，有兩個對映體，即L-蘋果酸和D-蘋果酸，分別呈左旋和右旋。在許多領域都有著廣泛的用途，生產蘋果酸的方法有許多，諸如化學合成法、生物合成法、直接發酵法(又稱一步發酵法)、兩步發酵法、酶轉化法、直接抽提法等。其中的化學合成法因為合成的是消旋蘋果酸，其產物很難實現良好的分離效果，在日后的研究中已經被淘汰不用。生物合成法主要采用聯L-蘋果酸和乳酸及固定化細胞聯產L-蘋果酸生產工藝。再有一步發酵法生產L-蘋果酸由于需要消耗比較大的能源物質，也很少有人繼續采用此方法。之后又有部分國內外人士提出使用固定化細胞和固定化酶法生產L-蘋果酸，并在之后形成了一定規模的工業化生產，但是人們仍然發現這種方法的產量過低，并且成本偏高。現如今，隨著科學技術的日漸發展，越來越多的人發現了生物酶這一物質的奇特之處，眾所周知，酶具有專一性強，高效的催化效率，以及酶促反應的催化環境相對較為溫和等特點，有著很好的工業化應用前景，酶轉化法省去一系列為保證對映選擇性或區域選擇性而使用的繁雜操作步驟，而且由于酶促反應環境的溫和性，解決了以往各種生產方法的條件苛刻性這一問題，國內孟津等改進傳統酶轉化法工藝與國外Efrem等對傳統裝置進行改進，使回收率大大提高。且有利于保護環境，節能減排。目前工業上生物酶法制備L-蘋果酸的關鍵酶是富馬酸酶。富馬酸酶，又名延胡索酸酶，作用是催化延胡索酸和蘋果酸之間的相互轉化。由于富馬酸酶在生產蘋果酸上起著關鍵的作用。富馬酸酶在自然界中廣泛存在于產氨短桿菌、脫氮副球菌、黃色短桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及短乳桿菌等微生物中。雖然富馬酸酶存在廣泛，但是在生物合成富馬酸酶的過程中，仍然遇到存在產率低，成本高的問題，這仍然將成為日后研究蘋果酸轉化的重點方向。
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是富馬酸酶提取的產率低、成本高。本專利技術的技術方案是一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，具體如下：構建表達富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌，液體培養工程菌，離心收集濕菌體細胞，，加入反應底物富馬酸鈉，全細胞催化至反應完全，收集反應液。具體的，所述反應溫度為30～40℃。優選的，所述反應溫度為35℃。具體的，所述反應pH為7～8。優選的，所述反應pH為7。進一步的，所述反應時間為8～12h。優選的，所述反應時間為10h。具體的，所述反應體系中，每10mL轉化合成體系中添加0.5～2g富馬酸鈉和0.05～2g濕菌體細胞。具體的，所述反應體系中，每10mL轉化合成體系中添加1g富馬酸鈉和0.1g濕菌體細胞。進一步的，所述的反應體系中還添加有終濃度為50mmoL.L-1的Ca2+或/和終體積分數為0.03％～0.06％的烷基酚聚氧乙烯醚OP。其中，所述富馬酸酶基因來自耐輻射球菌。具體的，構建表達富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌的過程如下：設計引物DR2627up和DR2627dn，以耐輻射球菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增；將PCR產物與T載體連接后轉化感受態細胞DH5α并進行篩選培養獲得陽性重組細胞；從陽性重組細胞中抽提質粒并進行酶切，并將酶切片段插入pET22b載體構建重組質粒pET22b-fumC，將重組質粒pET22b-fumC轉入感受態細胞BL21并進行篩選培養獲得重組富馬酸酶基因工程菌。進一步的，所述的引物DR2627up和DR2627dn的核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。本專利技術還提供了所述方法得到的富馬酸酶。蘋果酸轉化反應進程：在10mL含1g富馬酸鈉的最佳轉化體系中，加入誘導后、0.1g菌體細胞，置于水浴中反應，每間隔2h取樣檢測。結果表明：催化上述轉化過程均在10h時L-蘋果酸生產量達到最高，產率為95％(產率是指產物蘋果酸的量與加入的底物富馬酸鈉的比值)，隨著轉化反應的繼續進行，L-蘋果酸含量在減少，并在12h時反應達到平衡，這可能與富馬酸和蘋果酸之間是可逆轉化過程有關。本專利技術的有益效果：本申請利用分子生物學技術，通過重組大腸桿菌全細胞，以富馬酸鈉為轉化底物生產L-蘋果酸。本專利技術方法中L-蘋果酸的產率可達到95％。本專利技術為提高蘋果酸產量的研究提供方向，同時也為其他有機酸的研究奠定基礎。附圖說明圖1為PCR擴增產物和重組質粒雙酶切電泳驗證；其中，(a)為PCR擴增產物電泳驗證結果；1為PCR擴增條帶，2為DNAMarker(b)為重組質粒雙酶切電泳驗證結果，1為雙酶切產物，2為DNAMarker。圖2為重組菌種SDS-PAGE電泳驗證結果。其中，①為對照組；②、③、④分別為誘導2h、4h、6h的重組菌株。圖3為轉化溫度對重組富馬酸酶酶活的影響。圖4為pH對重組富馬酸酶酶活的影響。圖5為金屬離子對重組富馬酸酶活的影響。圖6為表面活性劑對酶轉化反應影響。具體實施方式下述實施例中用到的主要試劑、儀器、遺傳材料和培養基：TaqDNA聚合酶，限制性內切酶和T4DNA連接酶，質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均為北京鼎國昌盛有限公司提供；乙腈，色譜純；富馬酸鈉，L-蘋果酸等其他試劑均為分析純。高壓蒸汽滅菌鍋(TOMYSX-500)；；全溫搖床(金壇市盛藍儀器制造公司)；高效液相色譜儀(日本島津)；PCR儀(Bio-Rad)；電熱恒溫干燥箱(金壇市盛藍儀器制造公司)。耐輻射球菌Deinococcusradiodurans保藏號ATCC13939。TGY液體培養基：蛋白胨0.5％，酵母粉0.3％，葡萄糖0.1％。LB培養基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％。實施例1重組大腸桿菌的獲得以耐輻射球菌(D.radiodurans)富馬酸酶基因fumC序列(GenBank:CP015081.1)設計引物，分別在引物5＇端添加酶切位點以及保護堿基：DR2627up，gacacCATATGaccaaaacccgccaagaaacc(SEQIDNo.1)，下劃線所示為NdeI酶切位點以及保護堿基；DR2627dn，gacacCTCGAGgttgtgagtcatgcccagcgg(SEQIDNo.2)，下劃線所示為XhoI酶切位點以及保護堿基。提取耐輻射球菌(D.radiodurans)基因組DNA，然后以DR2627up和DR2627dn為引物，以耐輻射球菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：95℃預變性3min；(94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸120s)，括號內35個循環；72本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在于，具體如下：構建表達富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌，液體培養工程菌，離心收集濕菌體細胞，加入反應底物富馬酸鈉，待反應完全，收集反應液。/n

【技術特征摘要】
1.一種利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在于，具體如下：構建表達富馬酸酶基因的大腸桿菌工程菌，液體培養工程菌，離心收集濕菌體細胞，加入反應底物富馬酸鈉，待反應完全，收集反應液。


2.如權利要求1所述利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在于，所述反應溫度為30～40℃；優選的，所述反應溫度為35℃。


3.如權利要求1或2所述利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在于，所述反應pH為7～8；優選的，所述反應pH為7。


4.如權利要求1或2所述利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在于，所述反應時間為8～12h；優選的，所述反應時間為10h。


5.如權利要求1或2所述利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在于，所述反應體系中，每10mL轉化合成體系中添加0.5～2g富馬酸鈉和0.05～2g濕菌體細胞；優選的，所述反應體系中，每10mL轉化合成體系中添加1g富馬酸鈉和0.1g濕菌體細胞。


6.如權利要求1或2所述利用重組大腸桿菌全細胞催化合成L-蘋果酸的方法，其特征在...

【專利技術屬性】
技術研發人員：尹龍飛，付永前，羅希，鄭偉龍，孫小龍，
申請(專利權)人：臺州學院，
類型：發明
國別省市：浙江;33