一種利用鈍齒棒桿菌發酵生產1,4-丁二胺的方法技術

本發明專利技術公開了一種利用鈍齒棒桿菌發酵生產1,4?丁二胺的方法，屬于基因工程技術領域。通過大腸桿菌和鈍齒棒桿菌之間的穿梭質粒pXMJ19，將精氨酸脫羧酶編碼基因經突變后與胍丁胺酶編碼基因串聯成功并在精氨酸高產菌株中過表達。搖瓶發酵結果表明，原始菌不具有生產有活性的精氨酸脫羧酶和胍丁胺酶的能力，而重組工程菌可以完成L?精氨酸到1,4?丁二胺的轉化。同時基于此基因工程菌株具有高產L?精氨酸的特性，成功采用一步發酵法以葡萄糖為底物生產1,4?丁二胺。本發明專利技術方法生產1,4?丁二胺，具有效率高、副產物L?精氨酸、胍基丁胺和其他雜酸余量低的優點，后期對于產物1,4?丁二胺的分離純化更加容易。

【技術實現步驟摘要】
一種利用鈍齒棒桿菌發酵生產1,4-丁二胺的方法
本專利技術涉及一種利用鈍齒棒桿菌發酵生產1,4-丁二胺的方法，屬于基因工程

技術介紹
1,4-丁二胺(也稱1,4-二氨基丁烷或腐胺)屬于氨基酸衍生物，作為聚合物，藥物，農用化學品，表面活性劑和其他添加劑的組分，具有許多工業應用。由于它作為合成高性能聚酰胺尼龍-4,6的單體而倍受關注，尼龍-4,6因其高熔點、高結晶度、高耐熱性和高機械強度以及出色的耐溶劑性而成為一種優異的工程塑料。因此，1,4-丁二胺具有十分廣闊的市場應用前景。工業規模上1,4-丁二胺的生產主要是采用琥珀腈加氫的化學合成法，琥珀腈通過在丙烯腈中添加氰化氫產生。化學路線需要不可再生的石油化工產品作為原材料和相對苛刻的反應條件，以及昂貴的催化劑。由于反應物具有劇毒和易燃性，因此從環境和人類健康的角度來看，化學合成路線并不可取。而目前具有應用前景的生物法制備1,4-丁二胺的方法主要是酶轉化法，酶法轉化有兩種路徑：1、利用精氨酸脫羧酶與胍丁胺酶串聯表達將精氨酸轉化為1,4-丁二胺；2、利用鳥氨酸脫羧酶將鳥氨酸轉化為1,4-丁二胺。與化學合成法相比，利用酶法轉化生產1,4-丁二胺具有步驟簡單、副產物少以及綠色環保等優勢，但是酶法轉化需要以價格昂貴的精氨酸或鳥氨酸為底物，具有成本高的缺陷，這大大阻礙了酶法轉化生產1,4-丁二胺的工業化進程。雖然現有報道當中，有采用葡萄糖直接合成1,4-丁二胺，但是最終產量不高、產率低等缺點，例如：VolkerF.Wendisch等人研究公開的方法中，是采用通過優化啟動子和RBS元件，建立了ArgF精確調控策略的技術方案，但是生成的1,4-丁二胺的產量僅為19g·L-1，并且存在產率低等缺點，僅有0.16g·g-1葡萄糖(記載于“ImprovingputrescineproductionbyCorynebacteriumglutamicumbyfine-tuningornithinetranscarbamoylaseactivityusingaplasmidaddictionsystem”論文中)；JianZhongLiu等人研究公開的方法中，是通過過表達CgmA轉運蛋白，并系統集成前體合成模塊和OdhA調控模塊的強度優化的技術方案，使得生產率達到0.29g·g-1葡萄糖，但是生成的1,4-丁二胺的產量僅為12.4g·L-1(記載于“MetabolicevolutionandacomparativeomicsanalysisofCorynebacteriumglutamicumforputrescineproduction”論文中)。為此，創造以廉價葡萄糖為底物直接合成高價值1,4-丁二胺的綠色合成路線十分重要，并且，如何提高以葡萄糖為底物合成1,4-丁二胺的產量成為研究的熱點。
技術實現思路
技術問題：本專利技術要解決的技術問題是提供一種可低成本且高效合成1,4-丁二胺的重組菌株及其構建方法，及提供一種能夠以葡萄糖為底物高產1,4-丁二胺的方法。技術方案：為了解決上述技術問題，本專利技術提供了一種重組鈍齒棒桿菌，所述重組鈍齒棒桿菌同時表達了精氨酸脫羧酶突變體A533P和胍丁胺酶。所述精氨酸脫羧酶突變體是通過將氨基酸序列如SEQIDNO1所示的精氨酸脫羧酶的第533位由丙氨酸突變成脯氨酸得到的，命名為A533P。在本專利技術的一種實施方式中，所述精氨酸脫羧酶的核苷酸序列如SEQIDNO5所示。在本專利技術的一種實施方式中，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。在本專利技術的一種實施方式中，編碼所述胍丁胺酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO3所示。在本專利技術的一種實施方式中，編碼所述精氨酸脫羧酶突變體A533P的基因的核苷酸序列如SEQIDNO4所示。在本專利技術的一種實施方式中，所述重組鈍齒棒桿菌以C.crenatumSYPA5-5為表達宿主。在本專利技術的一種實施方式中，所述重組鈍齒棒桿菌以pXMJ19或pDXW10為表達載體。本專利技術還提供了上述重組鈍齒棒桿菌的構建方法，所述方法包括以下步驟：(1)將化學合成的精氨酸脫羧酶突變體基因speA和胍丁胺酶基因speB串聯后連接到表達載體pXMJ19上，構建重組質粒；(2)將步驟(1)制備得到的重組質粒轉化到C.crenatumSYPA5-5中，制備得到重組鈍齒棒桿菌。本專利技術還提供了一種生產1,4-丁二胺的方法，所述方法為將上述重組鈍齒棒桿菌發酵生產1,4-丁二胺。在本專利技術的一種實施方式中，所述方法為，將所述重組鈍齒棒桿菌接種至種子培養基中，培養得到種子液，將得到的種子液接種至發酵培養基中發酵制備得到1,4-丁二胺。在本專利技術的一種實施方式中，所述重組鈍齒棒桿菌接種至種子培養基中，在28-32℃，180-250r/min條件下培養24h，制備得到種子液。在本專利技術的一種實施方式中，所述制備得到的種子液按照10％(v/v)的接種量接種至發酵培養基中，在28-32℃，180-250rpm條件下發酵培養72-96h。在本專利技術的一種實施方式中，將種子液接種至發酵培養基進行發酵培養時，接種24h后加入IPTG，終濃度為0.5mM。本專利技術還提供了上述重組鈍齒棒桿菌在制備含有1,4-丁二胺的產品中的應用。有益效果(1)本專利技術構建了一種以葡萄糖為底物一步發酵法合成1,4-丁二胺的公認安全菌株C.crenatumSYPA5-5/pXMJ19-A533P-speB。以高產精氨酸的GRAS菌株C.crenatumSYPA5-5為出發菌株，構建具有精氨酸脫羧酶突變體和胍丁胺酶活性的重組鈍齒棒桿菌C.crenatumSYPA5-5/pXMJ19-A533P-speB，無需以價格昂貴的L-精氨酸為原料，能夠直接利用廉價的葡萄糖為原料進行1,4-丁二胺的生產，從而有效的降低1,4-丁二胺的生產成本。(2)發酵生產1,4-丁二胺時，含有野生酶的C.crenatum5-5/pXMJ19-speA-speB發酵液中僅積累到10.9g·L-1的1,4-丁二胺，而含有突變體A533P的菌株C.crenatum5-5/pXMJ19-A533P-speB發酵液中積累到15.43g·L-1的1,4-丁二胺，是含有野生酶的1,4-丁二胺的1.4倍。(3)采用本專利技術提供的方法進行發酵罐培養時，重組菌C.crenatumSYPA5-5/pXMJ19-A533P-speB發酵罐發酵液中可積累35.28g·L-1的1,4-丁二胺，實現無精氨酸添加，一步發酵法由葡萄糖到1,4-丁二胺的直接合成，并且發酵后測得精氨酸含量為0.78g·L-1，胍基丁胺含量為0.84g·L-1。附圖說明圖1：1g·L-1精氨酸標準品的HPLC液相圖。圖2：1g·L-1胍基丁胺標準品的HPLC液相圖。圖3：1g·L-11,4-丁二胺標準品的HPLC液相圖。圖4：發酵過程發酵液液相圖。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種重組鈍齒棒桿菌，其特征在于，同時表達了精氨酸脫羧酶突變體和胍丁胺酶，所述精氨酸脫羧酶突變體是通過將氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示的精氨酸脫羧酶第533位的丙氨酸突變成脯氨酸得到的。/n

【技術特征摘要】
1.一種重組鈍齒棒桿菌，其特征在于，同時表達了精氨酸脫羧酶突變體和胍丁胺酶，所述精氨酸脫羧酶突變體是通過將氨基酸序列如SEQIDNO1所示的精氨酸脫羧酶第533位的丙氨酸突變成脯氨酸得到的。


2.如權利要求1所述的重組鈍齒棒桿菌，其特征在于，所述胍丁胺酶的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。


3.如權利要求1或2所述的重組鈍齒棒桿菌，其特征在于，所述重組鈍齒棒桿菌以C.crenatumSYPA5-5為表達宿主。


4.如權利要求1～3任一所述的重組鈍齒棒桿菌，其特征在于，所述重組鈍齒棒桿菌以pXMJ19為表達載體。


5.構建權利要求1～4任一所述的重組鈍齒棒桿菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將化學合成的精氨酸脫羧酶突變體基因和胍丁胺酶基因串聯后連接到表達載體pXMJ19上，構建重組質粒；
(2)將步驟(1)制備得到的重組質粒...

【專利技術屬性】
技術研發人員：徐美娟，饒志明，楊鳳玉，楊套偉，張顯，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32