副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重組副溶血性弧菌減毒活疫苗及其制備方法和應用技術

本發明專利技術公開了一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株以及以此為基礎的疫苗。本發明專利技術所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株為不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因且外膜上高效表達lptD蛋白的菌株。本發明專利技術所述的疫苗為含有副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和藥學上可以接受的稀釋液，所述的疫苗的含量為每頭份含菌株濃度為10

【技術實現步驟摘要】
副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重組副溶血性弧菌減毒活疫苗及其制備方法和應用
本專利技術涉及一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和重組副溶血性弧菌減毒活疫苗及其制備方法和應用，屬于生物

技術介紹
弧菌的革蘭氏染色結果呈陰性，是一種嗜鹽細菌，廣泛存在于靠近河流以及海水的地區。由病原弧菌感染所引起的魚、蝦、貝類等的弧菌病是水產養殖動物最主要的細菌性疾病。目前，已發現有27種弧菌可引起弧菌病，其中以副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)最為常。副溶血性弧菌給人和各種生物帶來了潛在的危害，其不僅危害水產養殖業的健康發展，使魚蝦感染細菌性疾病而死亡，造成巨大經濟損失，同時也是我國主要的食源性致病菌。當前對弧菌病的預防和治療主要是投喂抗生素，但這種方出現了一定的缺陷，出現了藥物的殘留和菌體產生相應的抗藥性兩大問題，這已成為影響危害人們身體健康和食品安全，從而也導致了水產的一些作物出現了劣質和損失。外膜蛋白(outermembraneprotein)主要由革蘭氏陰性菌產生，位于細菌肽聚糖層的外部，是組成其細菌細胞壁的一種成分，是構成細菌外膜的一種重要結構，其在細菌中的含量很高，可達其胞質外結構全部組成的二分之一。作為外膜的主要組分，外膜蛋白在細菌的生命活動中起著重要作用，細菌正常形態的維持以及物質的合成、細菌的抗藥性等都離不開它。某些病原菌外膜蛋白具有粘附素作用,有助于病原菌對宿主細胞的粘附；某些病原菌外膜蛋白還具有抗吞噬、抗補體及抗血清殺菌等作用，有助于病原菌逃避宿主的免疫防御，從而達到致病目的。因為外膜蛋白是細菌的最外側的結構，所以在細菌侵襲宿主細胞時，各種不同的外膜蛋白可以與宿主細胞的表面蛋白或受體發生相互作用，介導病原菌對宿主細胞的感染，但同時，外膜蛋白也是最容易容易被宿主的免疫系統所識別并被免疫系統認作是抗原的一類蛋白，所以有些外膜蛋白可以誘導宿主產生具有高度保護性的免疫應答。因此，對于宿主來說，病原菌的外膜蛋白可能是具有重要保護作用的抗原，并且一些外膜蛋白在同屬不同種病原菌中高度保守，甚至一些蛋白在不同屬的細菌中也存在一定的保守性，在不同種或同種不同血清型菌株誘發的免疫應答中可產生一定程度的交叉保護作用，因此，細菌的外膜蛋白也是最具潛力的疫苗靶點之一。目前，已有較多關于弧菌外膜蛋白的免疫原性的研究表明許多外膜蛋白具有良好的免疫原性，這些蛋白包括如OmpW,OmpV,OmpU,OmpK,PsuA,PvuA,VPA1435,VP0764,VPA1186,VP1061，VP2850等。先前的研究通過免疫蛋白質組學技術也發現lptD,LamB,OmpA,OmpK,OmpU,VP0802,VP1243以及VP0966等具有免疫原性。這些研究結果表明，外膜蛋白能夠有效的刺激機體產生特異性抗體。此外，還有研究表明，某些外膜蛋白還可對相應病原菌的感染具有50-100％的免疫保護率，有些外膜蛋白還能夠顯著增強機體吞噬細胞的吞噬活性。OMPs是在革蘭氏陰性細菌中運輸脂多糖的一系列具有特殊功能蛋白質。它不僅是革蘭氏陰性細菌外膜的主要組分之一，脂多糖在細菌感染機體時也會發揮重要的作用。其結構以及功能已經被進一步的闡明，其致病機理也已經得到了充分的解釋。近年發現，革蘭氏陰性菌的脂多糖的跨膜轉運以及在外膜上的組裝是由一系列的轉運蛋白LptA-G蛋白質復合物共同作用完成的。而存在于細菌膜上的跨膜蛋白lptD在另一個轉運蛋白LptE的作用下，將脂多糖轉運至細菌外膜，形成細菌外膜重要結構。有研究證實在封閉了lptD的作用后，細菌的生長收到了很大程度的抑制，因此，lptD膜蛋白被認為是革蘭氏陰性細菌存活的“命門”。因而lptD對細菌的生理功能和毒力均具有關鍵作用。目前，lptD蛋白的三維結構已經得到解析(圖1)。目前，已有研究對副溶血弧菌lptD的免疫原性開展了研究，表明lptD具有良好的免疫原性，且序列分析表明lptD在所有弧菌中均存在，且氨基酸序列高度保守，尤其與幾種常見病原弧菌的序列同源性在90％以上，提示lptD是極具發展前景的疫苗靶位。因此，研制基于lptD為保護性抗原的減毒活疫苗，可為控制海水養殖動物弧菌病提供安全有效的免疫預防措施。
技術實現思路
本專利技術的要解決的技術問題一是構建一種外膜高效表達lptD蛋白的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株；二是以此弱毒株制備用于預防或治療弧菌病的疫苗。因此，本專利技術一方面公開了一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因。優選地，本專利技術所述的tdhA基因如SEQ.ID.NO1所示；所述的vcrD1基因如SEQ.ID.NO2所示，所述的vcrD2基因SEQ.ID.NO3所示。優選地，本專利技術所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株還含有能在副溶血性弧菌基因缺失弱毒株外膜上高效表達lptD蛋白的重組載體。優選地，本專利技術所述的能在副溶血性弧菌基因缺失弱毒株外膜上高效表達lptD蛋白的重組載體為pBBR1MCS-1-ompA-lptD。優選地，本專利技術所述的ompA的基因序列如SEQ.ID.NO4所示；所述的lptD的基因序列如SEQ.ID.NO5所示。再一方面，本專利技術還提供了一種制備所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株的方法，所述方法包括以下步驟：1)敲除副溶血性弧菌tdhA、vcrD1和vcrD2基因，得到不含tdhA、vcrD1和vcrD2基因的副溶血性弧菌；2)構建pBBR1MCS-1-ompA-lptD載體，并將載體轉移至步驟1)中的副溶血性弧菌中，篩選得到外膜上高效表達lptD蛋白的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株。再一方面，本專利技術還提供了一種重組副溶血性弧菌減毒活疫苗，所述的疫苗含有副溶血性弧菌基因缺失弱毒株和藥學上可以接受的稀釋液；所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因且外膜上高效表達lptD蛋白。優選地，本專利技術所述的活疫苗中每頭份含有副溶血性弧菌基因缺失弱毒株的濃度為108CFU。優選地，本專利技術所述的藥學上可以接受的稀釋液為過0.22μm濾膜的PBS緩沖液或過0.22μm濾膜的生理鹽水。本專利技術構建的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株的安全性實驗表明，該菌株的毒力顯著降低，對實驗動物無毒性(圖11)；而該菌株的免疫保護性分析表明其具有高效的免疫保護作用，可以100％保護實驗動物免于死亡(圖12/13)。并且在我們的初步分析中發現其具有一定的交叉保護性，其產生的抗血清可以與多種弧菌的膜蛋白發生免疫反應(圖14)。目前，雖然已經有許多研究針對弧菌做了疫苗開發的研究，例如針對哈維氏弧菌的OmpW的DNA疫苗，以OmpK為靶點的多用疫苗研究等，這些疫苗研究都為以細菌膜蛋白作為疫苗靶點進行疫苗開發提供了很多幫助。但是由于亞單位疫苗的局限性，如不易保存，不易接種，在漁用疫苗領域的實際生產應用中并沒有得到相應的重視，因此我們還需借此來進一步的創新突破漁用基因工程疫苗市場領域，新型的基因工程減毒疫苗不僅僅可以打破傳統亞單位疫苗的局限性，也可本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，其特征在于，所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因。/n

【技術特征摘要】
1.一種副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，其特征在于，所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株不含有tdhA、vcrD1和vcrD2基因。


2.根據權利要求1所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，其特征在于，所述的tdhA基因如SEQ.ID.NO1所示；所述的vcrD1基因如SEQ.ID.NO2所示，所述的vcrD2基因SEQ.ID.NO3所示。


3.根據權利要求1所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，其特征在于，所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株還含有能在副溶血性弧菌基因缺失弱毒株外膜上高效表達lptD蛋白的重組載體。


4.根據權利要求3所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，其特征在于，所述的能在副溶血性弧菌基因缺失弱毒株外膜上高效表達lptD蛋白的重組載體為pBBR1MCS-1-ompA-lptD。


5.根據權利要求4所述的副溶血性弧菌基因缺失弱毒株，其特征在于，所述的ompA的基因序列如SEQ.ID.NO4所示；所述的lptD的基因序列如SEQ.ID.NO5所示。

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【專利技術屬性】
技術研發人員：潘建義，高智超，查振中，查銀河，
申請(專利權)人：浙江洪晟生物科技股份有限公司，浙江理工大學，
類型：發明
國別省市：浙江;33