一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌及其應用制造技術

本發明專利技術公開了一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌及其應用，所述的格拉納達假單胞菌為格拉納達假單胞菌(Pseudomonas?granadensis)PF3402，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢市武昌珞珈山，保藏編號：CCTCC?M?2018545，保藏日期：2018年08月17日。本發明專利技術通過平板對峙抑菌、防病和盆栽促生實驗，首次從阿爾山上的土壤中篩選出能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病的生防菌PF3402，經鑒定該菌株為格拉納達假單胞菌，同時該菌株還具有促進煙苗生長的作用。試驗表明，本發明專利技術的PF3402對煙草黑脛病和根黑腐病的病原菌均具有良好的抑制作用，對兩種煙草病害的防效均能達到60％以上。

A growth-promoting Pseudomonas Granada strain capable of simultaneously controlling tobacco black shank and root black rot and its application

The invention discloses a Pseudomonas granadensis strain PF3402 which can simultaneously control tobacco black shank and root black rot and its application. The Pseudomonas granadensis strain PF3402 has been stored in a typical culture preservation center in China. The preservation address is Luojiashan, Wuchang, Wuhan City, and the preservation number is CCTCC M 2018. 545, date of preservation: 17 August 2018. The biocontrol bacteria PF3402 which can simultaneously control tobacco black shank disease and root rot disease was screened from the soil of Alpine Mountain for the first time by plate confrontation bacteriostasis, disease prevention and pot cultivation experiments. The strain was identified as Pseudomonas granada, and the strain also has the function of promoting tobacco seedling growth. The experiment shows that PF3402 of the invention has good inhibition effect on the pathogenic bacteria of tobacco black shank disease and root black rot disease, and the control effect on both tobacco diseases can reach more than 60%.

【技術實現步驟摘要】
一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌及其應用
本專利技術涉及一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌、篩選方法及其應用，屬于微生物

技術介紹
煙草是我國主要經濟作物之一，是植煙地區收入的重要來源，現已發現其具有較大的藥用和保健價值，且能夠作為生物科學最佳的模式材料。但煙草病害制約著煙草的健康生長，尤其是煙草黑脛病、煙草根黑腐病等土傳病害的發生會造成煙草減產，發病嚴重時會造成毀滅性的損失。煙草黑脛病是煙草生產上危害最嚴重的土傳病害之一，病原物為煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)。該病害多發生于大田成株期，癥狀主要有“黑脛”、“穿大褂”、“黑膏藥”、“碟片狀”、“腰爛”，煙草黑脛病屬高溫高濕型病害，相對濕度高時田間會出現發病高峰，嚴重時能夠造成整株成片死亡。煙草根黑腐病是世界性的煙草病害，也是我國煙草主要病害之一，其病原物為根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola)。根黑腐病主要發生在煙草根部，幼苗染病時可引起“猝倒”，使整株煙苗毀壞；較大煙株染病則病株葉片變黃、變薄，極大的影響煙草產量和品質，嚴重發生時可導致煙田絕收。隨著國內煙草種植面積擴大，連作煙田的增多，煙草黑脛病和煙草根黑腐病等土傳病害的危害不斷加重，在部分煙區已成為影響煙草發展的主要病害。生產上煙田防治土傳病害多以化學防治為主，農藥的長期使用容易產生環境污染、農藥殘留和耐藥病原菌等問題。生物防治在煙草土傳病害控制方面已經受到學者的重視，有關煙草黑脛病和根黑腐病生防菌的篩選及其菌劑和應用已被廣泛研究。我國已公開的對煙草黑脛病有效的生防菌株主要有枯草芽孢桿菌、沙福芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、青霉菌和淡紫擬青霉等幾類，而對煙草根黑腐病有效的生防菌較少，且能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病這兩種容易混合發生的生防菌株則更少，因此篩選對這兩種病害同時有效且對煙草有促生作用的生防菌株具有重要的理論和實踐意義。
技術實現思路
針對現有技術的不足，本專利技術的目的是提供一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌、篩選方法和應用，該格拉納達假單胞菌能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病，且能促進煙苗生長。為了實現上述目的，本專利技術所采用的技術方案是：一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌，所述的格拉納達假單胞菌為格拉納達假單胞菌(Pseudomonasgranadensis)PF3402，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢市武昌珞珈山，保藏編號：CCTCCNO：M2018545，保藏日期：2018年08月17日。一種能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌的篩選方法，采集內蒙古阿爾山上的土壤，稱取1g土壤，加入10ml無菌水中充分振蕩獲得土壤懸浮液，然后將土壤懸浮液搖勻后進行稀釋，取0.1ml稀釋液涂布于含8-羥基喹啉的KB固體平板上，28℃培養，至菌落長出后分離純化，然后篩選出對煙草疫霉和根串珠霉具有抑制效果的菌株，并鑒定，得到格拉納達假單胞菌PF3402。一種格拉納達假單胞菌在同時防治煙草黑脛病和根黑腐病方面的應用。一種格拉納達假單胞菌在促進煙草生長方面的應用。一種格拉納達假單胞菌在同時防治煙草黑脛病和根黑腐病并促進煙草生長方面的應用。一種格拉納達假單胞菌在制備同時防治煙草黑脛病和根黑腐病，和/或，促進煙草生長的菌劑中的應用。菌劑的制備方法為：將格拉納達假單胞菌接種于KB培養基中，在28℃、180rpm條件下振蕩培養16h制備種子菌，種子菌以3％的接種量接種于KB培養基中，在28℃、180rpm條件下發酵48h，形成發酵液，即為菌劑；發酵液中格拉納達假單胞菌活菌濃度為109～1010CFU/ml。KB培養基為：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氫二鉀1.5g，七水合硫酸鎂1.5g，添加蒸餾水定容至1000ml，混勻后分裝于三角瓶中，121℃滅菌30min。菌劑的使用方法為：菌劑用無菌水稀釋10倍，使稀釋液活菌濃度為108～109CFU/ml，灌根于煙草根部周圍；每3d灌根處理1次，共灌根3次。本專利技術有益效果：本專利技術的目的是生物防治煙草黑脛病和煙草根黑腐病等2種煙草主要病害，因此本專利技術通過平板對峙抑菌、防病和盆栽促生實驗，首次從阿爾山上的土壤中篩選出能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病的生防菌PF3402，經鑒定該菌株為格拉納達假單胞菌(Pseudomonasgranadensis)，同時該菌株還具有促進煙苗生長的作用。試驗表明，本專利技術的格拉納達假單胞菌對煙草黑脛病和根黑腐病的病原菌均具有良好的抑制作用，對兩種煙草病害的防效均能達到60％以上，能夠有效降低煙草根莖病害的發病率，其效果與現有的常用化學農藥相似。本專利技術篩選的格拉納達假單胞菌使用后不會產生抗藥性、農藥殘留、環境污染等化學農藥常見問題，對人畜健康、環境友好，符合人們對生態農業的需求。附圖說明圖1為菌株PF3402對煙草疫霉和根串珠霉的平板對峙抑菌試驗結果。圖2為菌株PF3402的菌落形態。圖左為對照，圖右為PF3402處理。圖3為菌株PF3402對煙葉過敏性試驗結果。圖左為陽性對照，圖右為菌株PF3402。圖4為菌株PF3402對煙草盆栽促生試驗結果。圖左為接種KB培養基，圖右為接種菌株PF3402。具體實施方式以下結合實施例對本專利技術的具體實施方式作進一步詳細說明。實驗材料：KB培養基：蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氫二鉀1.5g，七水合硫酸鎂1.5g，瓊脂20g(僅做固體培養基時添加)，添加蒸餾水定容至1000ml，混勻后分裝于三角瓶中，121℃滅菌30min。PDA培養基：馬鈴薯200g(切成邊長約1cm的小塊，放入800ml蒸餾水煮沸15min，雙層紗布過濾后留取濾液)，葡萄糖20g，瓊脂20g，加蒸餾水定容至1000ml，121℃滅菌30min。菌谷培養基：將谷子浸泡6h后用清水洗凈，淘盡癟空殼谷粒，煮至谷粒炸開成半開花狀，冷卻至半干，分裝入500ml三角瓶中高壓滅菌1h(115℃)，備用。裝入的谷粒量以不超過500ml刻度線為宜。本專利技術所用病原菌及其它原料、試劑均可由市場購得。實施例1、生防菌的分離在內蒙古阿爾山上采集種植煙草的根際土壤，稱取1g土壤，加入10ml無菌水中充分振蕩獲得土壤懸浮液，然后將土壤懸浮液搖勻后做適當稀釋(可進行倍比稀釋)，取0.1ml稀釋液涂布于含8-羥基喹啉(0.05g/L)的KB固體培養基上，于28℃恒溫培養箱中倒置培養36h，至菌落長出，挑取大小、顏色或形態不同的菌落在KB固體培養基表面劃線分離純化，獲得4株菌株，并分別命名為PF3402、PG3403、PG3101和PG3105。實施例2、生防菌的篩選利用平板對峙方法篩選生防菌：將煙草黑脛病病原疫霉和根黑腐病原根串珠霉接種在PDA培養基上，分別于25℃、28℃條件下培養5～10d，用滅過菌的打孔器將病原菌菌落打成直徑為5mm的圓形菌絲塊。將病原菌菌塊(煙草根串珠霉與煙草疫霉)與分離菌株接入PDA培養基上，病原菌菌塊與分離菌株相距20mm，同時設置單獨接種病原菌菌塊作為對照。每處理3次重復，1周后檢查對峙培養結果，結果見表1，其中PF本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌，其特征在于，所述的格拉納達假單胞菌為格拉納達假單胞菌(Pseudomonas?granadensis)PF3402，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢市武昌珞珈山，保藏編號：CCTCC?NO：M?2018545，保藏日期：2018年08月17日。

【技術特征摘要】
1.一株能夠同時防治煙草黑脛病和根黑腐病且具有促生作用的格拉納達假單胞菌，其特征在于，所述的格拉納達假單胞菌為格拉納達假單胞菌(Pseudomonasgranadensis)PF3402，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址：武漢市武昌珞珈山，保藏編號：CCTCCNO：M2018545，保藏日期：2018年08月17日。2.一種如權利要求1所述的格拉納達假單胞菌的篩選方法，其特征在于，采集內蒙古阿爾山上的土壤，稱取1g土壤，加入10ml無菌水中充分振蕩獲得土壤懸浮液，然后將土壤懸浮液搖勻后進行稀釋，取0.1ml稀釋液涂布于含8-羥基喹啉的KB固體培養基上，28℃培養，至菌落長出后分離純化，然后篩選出對煙草疫霉和根串珠霉具有抑制效果的菌株，并鑒定，得到格拉納達假單胞菌PF3402。3.一種如權利要求1所述的格拉納達假單胞菌在同時防治煙草黑脛病和根黑腐病方面的應用。4.一種如權利要求1所述的格拉納達假單胞菌在促進煙草生長方面的應用。5.一種如權利要求1所述的格拉納達...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉紅彥，文藝，千慧敏，趙輝，劉玉霞，李小杰，李淑君，倪云霞，劉新濤，李成軍，
申請(專利權)人：河南省農業科學院植物保護研究所，
類型：發明
國別省市：河南,41