一株用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及微生物學(xué)和生物技術(shù)，具體公開了一株用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌及其在防治灰霉病中應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)提供的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）1841，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC?No.15465，保藏日期：2018年3月20日。該菌株引進(jìn)自俄羅斯，有廣泛的抑菌譜和高抑制率。其發(fā)酵液、抑菌物質(zhì)及采用其發(fā)酵液制備制劑用于防治灰霉菌引起的灰霉病，及其它真菌病害，具有效果好、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，制備工藝簡單，使用方法簡單、無毒、無污染，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

A Bacillus amylolytica strain for inhibiting plant pathogenic fungi and its application

The invention relates to microbiology and biotechnology, in particular to a Bacillus amylolyticus strain for inhibiting plant pathogenic fungi and its application in controlling gray mold. The invention provides Bacillus amyloliquefaciens 1841, which is stored in the General Microbial Center of the China Microbial Species Preservation and Management Committee. The storage number is CGMCC No. 15465 and the storage date is March 20, 2018. The strain was introduced from Russia and has a broad spectrum of bacteriostasis and high inhibition rate. Its fermentation broth, bacteriostatic substances and its fermentation broth preparation are used to prevent and cure gray mould caused by gray mould and other fungal diseases. It has the advantages of good effect, industrialized production, simple preparation process, simple use method, non-toxic, non-polluting and green environmental protection.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一株用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
本專利技術(shù)涉及微生物學(xué)和生物技術(shù)，特別是一株用于抑制植物病原真菌生長的解淀粉芽孢桿菌1841及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
農(nóng)作物包括蔬菜、水果以及谷類的保存是農(nóng)業(yè)上的一個重要問題。植物病原真菌對植物的侵染會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會問題。病原真菌可在植物營養(yǎng)生長的不同階段影響植物，并且也會在蔬菜貯藏的階段造成巨大的損失。世界各國每年農(nóng)作物倉儲中會有25-50%受到真菌侵染，可造成高達(dá)30%的倉儲損失。植物病原真菌導(dǎo)致的病害還會降低食品和種子原料的質(zhì)量。染病的植物在生長季節(jié)還會成為了各種病菌的傳播源?；瘜W(xué)殺菌劑常被用于保護(hù)植物抵抗植物病原體的侵染，在農(nóng)作物進(jìn)倉倉儲前采用化學(xué)殺菌劑消毒可以顯著性的減少真菌病害。塊莖和塊根蔬菜的生產(chǎn)中會使用大量化學(xué)藥品作為殺菌劑。然而，化學(xué)殺菌劑也有許多缺點(diǎn)。最主要的負(fù)面作用是不具有特異性，污染環(huán)境，環(huán)境中的化學(xué)農(nóng)藥的積累，會使病原菌產(chǎn)生抗性?；瘜W(xué)殺菌劑用于農(nóng)產(chǎn)品也非常危險(xiǎn)，因?yàn)榛瘜W(xué)農(nóng)藥對于人類和動物有害。化學(xué)農(nóng)藥會在植物的營養(yǎng)生長中積累，最終在農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)生化學(xué)農(nóng)藥殘留，這可能會導(dǎo)致致癌、致畸以及致死的后果。目前，已經(jīng)開發(fā)出多種物理、化學(xué)和生物的方法用于抑制植物病原真菌生長。而產(chǎn)芽孢的芽孢桿菌屬細(xì)菌可能是最有效的用于植物保護(hù)的生物殺菌劑之一?；诩?xì)菌和其具有殺菌特性的代謝產(chǎn)物，我們可以應(yīng)用生物學(xué)方法替代其它手段來抑制植物病原真菌。當(dāng)前，一些可以抑制植物病原真菌生長的細(xì)菌菌株已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。而且，一些產(chǎn)芽孢細(xì)菌可以合成許多生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)可以抑制植物病原真菌的生長。生物殺菌劑的優(yōu)點(diǎn)包括：可以高效的使用，具有多種多樣的抗菌機(jī)制，可以誘導(dǎo)植物的系統(tǒng)抗性，具有形成生物被膜的能力，從而阻止植物病原真菌進(jìn)入食物和傳播。產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，與其它的生物活性產(chǎn)品相比具有許多生物技術(shù)上的優(yōu)勢。如專利文獻(xiàn)CN105349459A公開了一種解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用。所獲得的解淀粉芽孢桿菌GB1，分離自黃瓜老莖，該菌株具有的廣譜抑菌作用，其能夠抑制病原真菌分生孢子萌發(fā)、菌絲生長，并定植于傷口形成生物膜，有效阻止病原菌的侵染，抑制植物病原菌以及其他有害微生物的侵染繁殖，并具有促進(jìn)植物生長的機(jī)制，產(chǎn)生植物激素促進(jìn)植物生長發(fā)育，進(jìn)而增加產(chǎn)量，但其抑菌能力有限。目前能夠高效拮抗植物病原真菌的生防制劑還很少，因此篩選、分離出一種能夠高效拮抗植物病原菌的微生物菌株，并形成微生物菌劑，通過生物防治的方式降低植物病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來的危害，非常必要。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種能夠高效拮抗植物病原真菌的解淀粉芽孢桿菌菌株及微生物制劑和應(yīng)用，該制劑可以有效防治植物真菌病害，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品品質(zhì)。本專利技術(shù)通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌1841，分類命名為Bacillusamyloliquefaciens，于2018年3月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101），保藏編號為CGMCCNo.15465。所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）1841，是從俄羅斯引進(jìn)。通過對峙實(shí)驗(yàn)證明：所述解淀粉芽孢桿菌1841對細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuis），灰霉菌（Botrytiscinerea），玉米灰斑病菌（Cercosporazeae-maydis），尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum），稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）和核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）具有拮抗作用，并具有以下形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特征：1、在NBY培養(yǎng)基中形成灰色的、光滑邊緣，直徑4-5mm的粗糙扁平菌落。2、營養(yǎng)細(xì)胞是特別長直的桿狀細(xì)胞，經(jīng)常3-4個細(xì)胞形成鏈；游離的芽孢呈橢圓形，不超過細(xì)胞的數(shù)量，單細(xì)胞，周生鞭毛，形成芽孢，革蘭氏陽性，有廣泛的抑菌譜和高抑制率。3、具有廣譜的抑真菌活性，可以抑制以下植物病原真菌的生長：細(xì)鏈格孢菌（Alternariatenuis），灰霉菌（Botrytiscinerea），玉米灰斑病菌（Cercosporazeae-maydis），尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum），稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）和核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum）。4、需氧生長所需的碳源可以是：葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、麥芽糖和乳糖。當(dāng)使用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露糖醇作為碳源時，它產(chǎn)生酸和乙偶姻，不產(chǎn)生氣體，并且形成水解酶，水解淀粉和酪蛋白。所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）1841的分子鑒定結(jié)果如下：以菌株1841基因組總DNA為模板，采用通用16SrDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1.3kb的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序，其16SrDNA系列如SEQUENCELISTING所示，該片段長度為1385bp，具有典型16SrDNA特征。通過NCBI上BLAST比對表面該菌株與解淀粉芽孢桿菌同源性最高，又以菌株1841基因組總DNA為模板，擴(kuò)增gyrB基因，進(jìn)行比對，進(jìn)一步驗(yàn)證為解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）。本專利技術(shù)還提供了的一種含有解淀粉芽孢桿菌1841的微生物菌劑。所述微生物菌劑中含有解淀粉芽孢桿菌1841的總活菌數(shù)不低于8×109個/g。本專利技術(shù)進(jìn)一步提供了所述微生物菌劑在防治灰霉病及其它真菌病害中的應(yīng)用。所述微生物菌劑的制備方法包括以下步驟：步驟一：將培養(yǎng)好的種子液按體積比2-5%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-37℃，補(bǔ)料培養(yǎng)48-72小時，得到發(fā)酵液；步驟二：將步驟一的發(fā)酵液與基質(zhì)等體積混合均勻，然后于65-90℃干燥至以重量百分比計(jì)的含水率低于5%，得到微生物菌劑。步驟一中，所述種子液通過下述方法獲得：先將解淀粉芽孢桿菌菌株1841劃線轉(zhuǎn)接到PDA平板中，置于培養(yǎng)箱28-37℃恒溫培養(yǎng)24-48小時；再將獲得的解淀粉芽孢桿菌菌株1841的菌苔接種到PDA液體培養(yǎng)基中，28-37℃搖床振蕩培養(yǎng)24-48小時得到種子液。步驟一中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下按體積百分比計(jì)的酵母浸粉1-3%、糖蜜1-4%、玉米蛋白粉1-3%、磷酸二氫鉀0.01-0.06%、硫酸鎂0.01-0.05%、碳酸鈣0.1-0.5%、氯化鈉0.05-0.1%，連續(xù)補(bǔ)加酵母粉、大豆蛋白粉，氨水調(diào)pH值6.5-7.5。步驟二中，所述的基質(zhì)選自微粉高嶺土或微粉硅藻土。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：1、本專利技術(shù)提供的用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）1841，引進(jìn)自俄羅斯，在NBY培養(yǎng)基中形成灰色的、光滑邊緣，直徑4-5mm的粗糙扁平菌落，營養(yǎng)細(xì)胞是特別長直的桿狀細(xì)胞，經(jīng)常3-4個細(xì)胞形成鏈；游離的芽孢呈橢圓形，不超過細(xì)胞的數(shù)量，單細(xì)胞，周生鞭毛，形成芽孢，革蘭氏陽性，有廣泛的抑菌譜和高抑制率。2、本專利技術(shù)提供的含有解淀粉芽孢桿菌1841的微生物菌劑具有以下積本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一株用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌1841，其特征在于：所述解淀粉芽孢桿菌于2018年3月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.15465。

【技術(shù)特征摘要】
1.一株用于抑制植物病原真菌的產(chǎn)芽孢解淀粉芽孢桿菌1841，其特征在于：所述解淀粉芽孢桿菌于2018年3月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.15465。2.如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌1841在拮抗灰霉病病原菌中的應(yīng)用。3.一種微生物菌劑，其特征在于：含有權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌1841。4.如權(quán)利要求3所述的微生物菌劑，其特征在于：所述微生物菌劑中含有解淀粉芽孢桿菌1841的總活菌數(shù)不低于8×109個/g。5.如權(quán)利要求3或4所述的微生物菌劑在防治番茄灰霉病中的應(yīng)用。6.如權(quán)利要求3所述的微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟：步驟一：將培養(yǎng)好的種子液按體積比2-5%的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28-37℃，補(bǔ)料培養(yǎng)48-72小時，得到發(fā)酵液；步驟二：將步驟一的發(fā)酵液與基質(zhì)等體積混合均勻，然后于65-90℃干燥至...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫群，劉健，熊仁科，左建英，魯?shù)婪颉ぐ韶惪▉?/a>，娜塔利亞·庫澤那塔索娃，
申請(專利權(quán))人：四川大學(xué)，四川龍蟒福生科技有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：四川,51