一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法及應用方法技術

本發明專利技術公開了一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，以自然發酵的豬糞鋸末堆為菌源樣品，加入高溫富集培養基，富集過后以剛果紅選擇性平板高溫篩選，選擇降解直徑/菌落直徑較大的菌株再次高溫培養，以濾紙條為纖維素降解指示物，當培養基內指示物崩解，即可得到高效的高溫纖維素降解菌，最后進行純化。通過上述方法，能夠有效地篩選到性能穩定的耐高溫纖維素降解芽孢桿菌。本發明專利技術還公開了一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌應用方法，制成菌劑后可直接應用于豬糞發酵床，便于產業化實施，具備廣闊的應用前景。

Screening and application of a thermostable cellulose-degrading Bacillus

The present invention discloses a screening method for high temperature resistant cellulose-degrading bacillus. The natural fermented pig manure sawdust pile is used as the bacterial source sample, and high temperature enrichment medium is added. After enrichment, Congo red selective plate is used for high temperature screening, and the strains with larger degradation diameter/colony diameter are selected for high temperature culture again. The filter paper is used as the cellulose degradation indicator, and when the indicator in the medium disintegrates* High-efficient cellulose-degrading bacteria can be obtained and purified finally. Through the above methods, Bacillus thermophilic cellulose-degrading bacteria with stable performance can be effectively screened. The invention also discloses an application method of cellulose-degrading Bacillus resistant to high temperature, which can be directly applied to pig manure fermentation bed after making the bacterium agent, and is convenient for industrialization and implementation, and has broad application prospects.*

【技術實現步驟摘要】
一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法及應用方法
本專利技術涉及農業生物
，尤其是涉及一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法及應用方法。
技術介紹
發酵床養豬技術是根據微生態原理和生物發酵理論，利用微生物對畜禽糞尿“原位降解”，達到生態環境“零污染”的新型養殖模式。該技術最先在日本出現并獲得推廣口，近年來在我國得到快速的推廣和應用。發酵床養殖技術的關鍵是養床，其中對墊料的科學養護與管理顯得尤其重要，管理良好的墊料有助于畜禽糞便的消化與分解，還能延長墊料的使用期來提高養殖效益。但是現在用于養豬發酵床中的菌劑施用于豬糞墊料上時，會受到土著菌的拮抗，不利于墊料的腐熟，另外，現有菌劑對高溫耐受能力有限，若發酵大于60℃則會影響堆肥效果。現在很少有研究從豬糞發酵床生境的原生生物中篩選出高溫纖維素降解菌株。以豬糞墊料為菌源篩選的該類菌因為來源于豬糞墊料的土著菌，在制成菌劑后施用于豬糞墊料上時，不會受到土著菌的拮抗，因而更有利于墊料的腐熟。綜上，篩選豬糞土著的高效纖維素降解菌，尤其是芽抱桿菌對于纖維素資源化利用尤其重要。
技術實現思路
本專利技術的專利技術目的是為了提供一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，得到的耐高溫纖維素降解芽孢桿菌，對纖維素具有較強降解能力，且產物不會對環境造成污染，最高可在60℃高溫下生長繁殖，可制成嗜熱發酵床添加菌劑，在豬糞的發酵床領域具備應用前景。本專利技術還提供了一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌在豬糞發酵床中的應用。為了實現上述目的，本專利技術采用以下技術方案：本專利技術的一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，具體步驟為：(1)將20wt％豬糞、40wt％木屑、60wt％谷殼混合后，在60℃溫度、60％濕度、pH7.5的條件下發酵二個月，得發酵豬糞鋸末；(2)以所得的發酵豬糞鋸末為菌源樣品，取10g發酵鋸末置于100mL以CMC-Na為唯一碳源的富集培養基中，50℃、150rpm恒溫培養，得富集液；(3)取100μl富集液涂布于CMC-剛果紅培養基平板上，之后于50℃培養箱中倒置恒溫培養，5天后觀察，平板上出現透明水解圈，選取降解直徑大的菌株直接接種于放有濾紙條的富集培養基內，待培養基內濾紙條崩解，即為降解能力較強的菌株；(4)挑取少量菌株在LB固體培養基上劃線直至獲得單菌落，再將獲得的單菌落在以CMC-Na為唯一碳源的富集培養基上連續培養6代，待菌落形態穩定后，即得純培菌株，得到的菌株命名為枯草芽孢桿菌SM-5-1(BacillusSubtilisSM-5-1)，已于2018年7月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2018415。本專利技術以自然發酵的豬糞鋸末堆為菌源樣品，加入高溫富集培養基，富集過后以剛果紅選擇性平板高溫篩選，選擇降解直徑/菌落直徑較大的菌株再次高溫培養，以濾紙條為纖維素降解指示物，當培養基內指示物崩解，即可得到高效的高溫纖維素降解菌，最后進行純化。通過上述方法，能夠有效地篩選到性能穩定的耐高溫纖維素降解芽孢桿菌。本專利技術的耐高溫纖維素降解芽孢桿菌不僅對纖維素具備較好的降解能力，且產物不會對環境造成污染，由于其來源于豬糞，作為豬糞土著菌株，能減少與土著菌的抑制作用，對于豬糞的堆肥和發酵床均具備較高的降解能力，同時具備高溫耐受性，可制成嗜熱發酵床添加菌劑，在豬糞的發酵床領域具備廣闊的應用前景。作為優選，以富集培養基總質量為基準，富集培養基由98％Mandel營養液和2％的羧甲基纖維素組成，Mandel營養液中營養鹽的組成為：2g/LNaNO3，1.5g/LK2HPO4，1.5g/LCaCl2，0.3g/LMgSO4，0.005g/LFeSO4.7H2O，0.0016g/LMnSO4.H2O，0.0014g/LZnSO4.H2O，0.0005g/LCoCl2，pH5.5；121℃，20min，滅菌。作為優選，所述濾紙條規格為1×6cm。作為優選，所述枯草芽孢桿菌SM-5-1(BacillusSubtilisSM-5-1)在60℃的條件下CMCase和FPase活性分別為121.18U/mL和104.14U/mL。作為優選，所述枯草芽孢桿菌SM-5-1(BacillusSubtilisSM-5-1)采用-80℃低溫冷凍保藏法保藏。一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌應用方法，具體步驟為：(1)制備發酵床菌劑將枯草芽孢桿菌SM-5-1(BacillusSubtilisSM-5-1)接種于LB液體培養基中，24h后將菌液接種至由87wt％的麩皮，10wt％的礱糠，3wt％生石灰，70wt％的水組成的基質中，50℃發酵2d，出料烘干后磨成細粉，即得高溫發酵床菌劑。(2)發酵先將木屑與礱糠按質量比4:6混合，得墊料；再在墊料中加入豬糞，一立方墊料加8kg，加水調整水分含量為50～60％后得堆料；最后在堆料中添加為堆料質量0.5～1％的高溫發酵床菌劑，當堆體溫度達到頂峰且逐漸下降至45℃時完成第一次發酵，然后每5-6天翻堆1次，共翻堆3次，即制得生物有機肥。因此，本專利技術具有如下有益效果：(1)提供了一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，得到的耐高溫纖維素降解芽孢桿菌，對纖維素具有較強降解能力，且產物不會對環境造成污染，最高可在60℃高溫下生長繁殖，可制成嗜熱發酵床添加菌劑，在豬糞的發酵床領域具備廣闊的應用前景；(2)提供了一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌應用方法，步驟簡單，便于產業化實施。附圖說明圖1是實施例1枯草芽孢桿菌SM-5-1(BacillusSubtilisSM-5-1)培養形態圖。圖2是實施例1中崩解實驗的形態圖。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術做進一步的描述。實施例1(一)菌種篩選(1)將20wt％豬糞、40wt％木屑、60wt％谷殼混合后，在60℃溫度、60％濕度、pH7.5的條件下發酵二個月，得發酵豬糞鋸末；(2)以所得的發酵豬糞鋸末為菌源樣品，取10g發酵鋸末置于100mL以CMC-Na為唯一碳源的富集培養基中，50℃、150rpm恒溫培養，得富集液，以富集培養基總質量為基準，富集培養基由98％Mandel營養液和2％的羧甲基纖維素組成，Mandel營養液中營養鹽的組成為：2g/LNaNO3，1.5g/LK2HPO4，1.5g/LCaCl2，0.3g/LMgSO4，0.005g/LFeSO4.7H2O，0.0016g/LMnSO4.H2O，0.0014g/LZnSO4.H2O，0.0005g/LCoCl2，pH5.5；121℃，20min，滅菌。(3)取100μl富集液涂布于CMC-剛果紅培養基平板上，之后于50℃培養箱中倒置恒溫培養，5天后觀察，平板上出現透明水解圈，選取降解直徑大的菌株直接接種于放有規格為1×6cm濾紙條的富集培養基內，待培養基內濾紙條崩解，即為降解能力較強的菌株，以富集培養基總質量為基準，富集培養基由98％Mandel營養液和2％的羧甲基纖維素組成，Mandel營養液中營養鹽的組成為：2g/LNaNO3，1.5g/LK2HPO4，1.5g/LCaCl2，0.3g/LMgSO4，0.005g/LFeSO4.7H2O，0.0016g/LMnSO4.H2O，0.0014g/LZnSO4.H2O，0.0005g/LCoCl2，pH5.5；本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，其特征在于，具體步驟為：(1)將20wt％豬糞、40wt％木屑、60wt％谷殼混合后，在60℃溫度、60％濕度、pH7.5的條件下發酵二個月，得發酵豬糞鋸末；(2)以所得的發酵豬糞鋸末為菌源樣品，取10g發酵鋸末置于100mL以CMC?Na為唯一碳源的富集培養基中，50℃、150rpm恒溫培養，得富集液；(3)取100μl富集液涂布于CMC?剛果紅培養基平板上，之后于50℃培養箱中倒置恒溫培養，5天后觀察，平板上出現透明水解圈，選取降解直徑大的菌株直接接種于放有濾紙條的富集培養基內，待培養基內濾紙條崩解，即為降解能力較強的菌株；(4)挑取少量菌株在LB固體培養基上劃線直至獲得單菌落，再將獲得的單菌落在以CMC?Na為唯一碳源的富集培養基上連續培養6代，待菌落形態穩定后，即得純培菌株，得到的菌株命名為枯草芽孢桿菌SM?5?1(Bacillus?Subtilis?SM?5?1)，已于2018年7月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO:M?2018415。

【技術特征摘要】
1.一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，其特征在于，具體步驟為：(1)將20wt％豬糞、40wt％木屑、60wt％谷殼混合后，在60℃溫度、60％濕度、pH7.5的條件下發酵二個月，得發酵豬糞鋸末；(2)以所得的發酵豬糞鋸末為菌源樣品，取10g發酵鋸末置于100mL以CMC-Na為唯一碳源的富集培養基中，50℃、150rpm恒溫培養，得富集液；(3)取100μl富集液涂布于CMC-剛果紅培養基平板上，之后于50℃培養箱中倒置恒溫培養，5天后觀察，平板上出現透明水解圈，選取降解直徑大的菌株直接接種于放有濾紙條的富集培養基內，待培養基內濾紙條崩解，即為降解能力較強的菌株；(4)挑取少量菌株在LB固體培養基上劃線直至獲得單菌落，再將獲得的單菌落在以CMC-Na為唯一碳源的富集培養基上連續培養6代，待菌落形態穩定后，即得純培菌株，得到的菌株命名為枯草芽孢桿菌SM-5-1(BacillusSubtilisSM-5-1)，已于2018年7月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2018415。2.根據權利要求1所述的一種耐高溫纖維素降解芽孢桿菌篩選方法，其特征在于，以富集培養基總質量為基準，富集培養基由98％Mandel營養液和2％的羧甲基纖維素組成，Mandel營養液中營養鹽的組成為：2g/LNaNO3，1.5g/LK2HPO4，1.5g/LCaCl2，0.3g/LMgSO4，0.005g/LFeSO4.7H2O，0.0016g/LMnSO4....

【專利技術屬性】
技術研發人員：湯江武，沈琦，孫宏，吳逸飛，李園成，姚曉紅，王新，
申請(專利權)人：浙江省農業科學院，
類型：發明
國別省市：浙江,33