一種煙草土壤戴氏菌及其分離方法和應用技術

本發明專利技術提供了一種煙草土壤戴氏菌及其分離方法和應用，該細菌的微生物學分類命名為煙草土壤戴氏菌Dyellatabacisoli?L4?6，已于2018年6月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?1.16273。本發明專利技術從土壤中分離得到的煙草土壤戴氏菌L4?6，可用于對香原料植物進行發酵，所得到的發酵產物具有提高香原料植物提取物品質的作用。

A Kind of Deinococcus in Tobacco Soil and Its Isolation Method and Application

The present invention provides a method for isolation and application of Daisy bacteria in tobacco soil. The microbiological classification of the bacteria is named Dyellatabacisoli L4_6 in tobacco soil. It has been stored in the General Microbial Center of China Microbial Species Preservation and Management Committee on June 19, 2018, and the storage number is CGMCC 1.16273. The tobacco soil Daisy L4_6 isolated from the soil of the invention can be used for fermenting aroma raw materials plants, and the fermentation products obtained have the effect of improving the quality of aroma raw materials plant extracts.

【技術實現步驟摘要】
一種煙草土壤戴氏菌及其分離方法和應用
本專利技術屬于生物
，具體涉及一種煙草土壤戴氏菌及其分離方法和應用。
技術介紹
加香加料是卷煙工藝中的關鍵環節，是完善產品風格的決定性因素和提高卷煙香氣質量的有效手段之一。目前，煙用香料按來源分為三類，即來自非煙草的天然植物香精油、浸膏等；來自非煙草的天然植物香料，如從各種植物的花、果實、根、莖、葉中提取的精油浸膏、酊劑等；人工合成的香料，如醇、醛、酮等單體香料。按香料生產方法的不同主要分為兩種，即采用各種分離手段直接從煙草或其它植物中提取的天然香料和采用化學反應合成的香料。目前，這兩種方法都有其優點，但均存在一定的局限性。如直接從植物中提取天然香料，雖然生產操作簡單，但存在改善卷煙抽吸效果不明顯等缺點；采用化學合成的香料，雖然生產過程易于控制，但也存在香氣單調、不自然等缺點。近年來，隨著微生物技術日新月異的發展，微生物法生產香料的工作已取得了很多進展。微生物種類豐富，長期以來人們利用純培養技術對環境中的微生物進行調研和開發利用，微生物資源在科技研究及生物產業中的重要性也日益凸顯。世界上許多國家都在搜集、保存各種微生物資源，微生物資源的不斷豐富將為我國生物技術的發展奠定堅實的物質基礎。利用微生物對香原料進行發酵，可以增加傳統提取香原料中多種香氣物質的含量，提升香氣豐富性。產香微生物，即能夠產生具有芳香氣味物質的微生物。目前，已經得到應用的產香微生物主要包括生香活性干酵母(生香ADY)、假絲酵母、乳酸菌、黑曲霉等。但是應用到卷煙中的微生物還很少，而且增香效果也不太理想。
技術實現思路
*除非另有說明，本專利技術中所采用的百分數均為質量百分數。本專利技術第一方面涉及一種具有產香功能的微生物煙草土壤戴氏菌L4-6，其是從云南昆明煙草種植基地煙草土壤樣品中分離得到的，對其進行了形態學、生理生化性質和16SrDNA分析，鑒定結果表明其屬于煙草土壤戴氏菌，微生物學分類命名為煙草土壤戴氏菌DyellatabacisoliL4-6，已于2018年6月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱：CGMCC)保藏，保藏編號為CGMCC1.16273，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所。本專利技術分離得到的煙草土壤戴氏菌L4-6菌株的主要形態特征和生理生化性質特征為：在大多數培養基上生長良好，在R2A瓊脂培養基上，菌落邊緣整齊，中間凸起，呈黃色。明膠液化，氧化酶、過氧化氫酶、吐溫20，40，60和80水解呈陽性，淀粉水解、纖維素水解，酪蛋白水解呈陰性，不產生硫化氫，不產生黑色素。能利用麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、乳糖、甘露糖、甘油、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸。細胞膜的極性脂成分主要包括磷脂酰甘油、雙磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺，細胞的呼吸醌為泛醌-8(Q-8)。本專利技術所分離得到的煙草土壤戴氏菌L4-6的16SrDNA基因核苷酸序列如序列表所示，該序列已遞交國際核苷酸序列數據庫(GenBank)，序列檢索號：MF370623。本專利技術第二方面涉及一種分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，包括以下步驟：a、從自然環境中取土壤樣品，加無菌水，搖床振蕩，加無菌水繼續稀釋并涂布于LB平板培養基上進行培養，挑選單菌落，純化，得到分離的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中備用；b、將步驟a分離的微生物菌液接種到LB液體培養基中，搖床振蕩，培養至菌液濃度為光密度OD＝2.0，制得種子液；c、將步驟b制得的種子液接種在篩選培養基中，搖床振蕩，篩選產生香氣的微生物，構建系統發育樹進行分子鑒別。上述分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，步驟a中的土壤樣品取自云南昆明煙草種植基地。上述分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，步驟a中LB平板培養基的組成如下：每950mL雙蒸水(ddH2O)中加入胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化鈉10g；調節PH至7.0，定容至1000mL，再加入瓊脂粉15g，121℃，20min高壓滅菌，待冷卻至50-60℃時，倒制平板。上述分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，步驟a中搖床振蕩溫度為30℃，振蕩速度180rpm，振蕩時間30min，用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在LB平板培養基上的培養溫度為30℃，培養時間48h，甘油的加入量為分離的微生物菌液體積的20％，冰箱溫度為-80℃。上述分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，步驟b中LB液體培養基的組成如下：每950ml雙蒸水(ddH2O)中加入胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化鈉10g；調節PH至7.0，定容至1000mL，121℃，20min高壓滅菌。上述分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，步驟b中搖床振蕩溫度為30℃，振蕩速度160rpm；步驟c中搖床振蕩溫度為30℃，振蕩速度160rpm，振蕩時間3-5天。上述分離、培養和鑒別如本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，步驟c中篩選培養基為R2A液體培養基，組成如下：葡萄糖0.5g；酵母膏0.5g；蛋白胨0.5g；酸水解酪蛋白0.5g；可溶性淀粉0.5g；丙酮酸鈉0.3g；磷酸氫二鉀0.3g；硫酸鎂0.05g；蒸餾水1000ml，pH7.2。本專利技術第三方面涉及一種利用本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6發酵制備生物香料的方法，其特征在于，包括如下步驟：將煙草土壤戴氏菌L4-6擴大培養后接種于發酵培養基中，28℃下搖瓶培養6天，用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，濃縮后所得澄清紅棕色液體，即為生物香料。本專利技術第四方面涉及一種利用本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6發酵香原料植物以制備香原料的方法，包括如下步驟：a、煙草土壤戴氏菌L4-6的活化培養：將煙草土壤戴氏菌L4-6接種到發酵培養基中，煙草土壤戴氏菌L4-6的接種量為發酵培養基的10％，pH7.2，28℃下搖瓶培養6天，得到煙草土壤戴氏菌L4-6活化菌液；b、將香原料植物干燥粉碎，加入15～22倍蒸餾水，滅菌；c、將步驟a制得的煙草土壤戴氏菌L4-6活化菌液接種到步驟b的香原料植物中，煙草土壤戴氏菌L4-6活化菌液的接種量為步驟b中所加入的蒸餾水的1.5％～2.5％，28℃下搖瓶培養6天，得到發酵液；d、將步驟c制得的發酵液在50～80℃下加熱回流1～3h，得到提取液；e、步驟d制得的提取液抽濾得到濾液，濾液離心，取上清液，減壓濃縮成浸膏，即得香原料。上述利用本專利技術第一方面所述的煙草土壤戴氏菌L4-6發酵香原料植物以制備香原料的方法，發酵培養基的組成如下：大豆粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，氯化鈉2.5g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000mL。本專利技術具有以下有益效果：(1)本專利技術首次從云南昆明煙草種植基地煙草土壤樣品中分離得到新的試驗菌種L4-6，經形態學、生理生化性質和16SrDNA分析表明該菌株是一種新的細菌，微生物學分類命名為煙草土壤戴氏菌DyellatabacisoliL4-6；(2)本專利技術從土壤中分離得到的煙草土壤戴氏菌L4-6，其發酵提取物具有特殊香氣，加入本文檔來自技高網...

【技術保護點】
1.一種煙草土壤戴氏菌，其特征在于，其微生物學分類命名為煙草土壤戴氏菌Dyellatabacisoli?L4?6，已于2018年6月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?1.16273。

【技術特征摘要】
1.一種煙草土壤戴氏菌，其特征在于，其微生物學分類命名為煙草土壤戴氏菌DyellatabacisoliL4-6，已于2018年6月19日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC1.16273。2.一種分離、培養和鑒別權利要求1所述的煙草土壤戴氏菌L4-6的方法，其特征在于，包括以下步驟：a、從自然環境中取土壤樣品，加無菌水，搖床振蕩，加無菌水繼續稀釋并涂布于LB平板培養基上進行培養，挑選單菌落，純化，得到分離的微生物菌液，加入甘油、置于冰箱中備用；b、將步驟a分離的微生物菌液接種到LB液體培養基中，搖床振蕩，培養至菌液濃度為OD＝2.0，制得種子液；c、將步驟b制得的種子液接種在篩選培養基中，搖床振蕩，篩選產生香氣的微生物，構建系統發育樹進行分子鑒別。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟a中搖床振蕩溫度為30℃，振蕩速度180rpm，振蕩時間30min，用無菌水稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍，在LB平板培養基上的培養溫度為30℃，培養時間48h，甘油的加入量為分離的微生物菌液體積的20％，冰箱溫度為-80℃。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟b中搖床振蕩溫度為30℃，振蕩速度160rpm，步驟c中搖床振蕩溫度為30℃，振蕩速度160rpm，振蕩時間3-5天。5....

【專利技術屬性】
技術研發人員：段焰青，劉秀明，黨立志，張玲，劉娟，焦俊，張翼鵬，
申請(專利權)人：云南中煙工業有限責任公司，
類型：發明
國別省市：云南,53