巨菌草根際促生菌及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及巨菌草根際促生菌及其應(yīng)用，巨菌草根際促生菌，包括溶磷固氮菌株NP?01、溶磷固氮菌株NP?02、固氮產(chǎn)IAA菌株N?01、固氮菌株N?02、固氮菌株N?03、固氮菌株YB?08、溶磷菌株N?06、溶磷菌株YB?10、溶磷產(chǎn)IAA菌株YB?07、溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB?09中的一種或多種，還提供了相應(yīng)的促生菌劑和巨菌草生物有機(jī)肥，有機(jī)肥還包括組分A：巨菌草秸稈、新鮮牛糞、羊糞、雞糞、生物有機(jī)腐熟劑，先將組分A混合，再高溫干發(fā)酵，翻堆過(guò)程及時(shí)噴灑水分，將促生菌菌株制作成菌懸液，菌懸液發(fā)酵制作成菌劑后，等比例混合加入堆肥中，控制水分和溫度，放置72h即可。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供的巨菌草根際促生菌及菌劑和有機(jī)肥，能顯著地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)。

Rhizosphere Growth Promoting Bacteria of Giant Fungus Grass and Its Application

The invention relates to the field of agricultural microorganisms, in particular to the rhizosphere growth-promoting bacteria of Giant Fungus Grass and its application. The rhizosphere growth-promoting bacteria of Giant Fungus Grass include phosphorus-soluble nitrogen-fixing bacteria NP 01, phosphorus-soluble nitrogen-fixing bacteria NP 02, nitrogen-fixing IAA strain N 01, nitrogen-fixing bacteria N 02, nitrogen-fixing bacteria N 03, nitrogen-fixing bacteria YB 08, phosphorus-solubilizing bacteria N 06, phosphorus-solubilizing bacteria YB 10, phosphorus-solubilizing IAA strain YB 07, phosphorus-solubilizing phosphorus-producing strain YB 07 One or more of the IAA strains YB 09 produced by nitrogen fixation are provided with corresponding growth-promoting agents and bio-organic fertilizers. Organic fertilizers also include component A: Giant Straw Straw, fresh cow dung, sheep dung, chicken dung and bio-organic maturing agent. Component A is mixed first, then dried by high temperature fermentation, water is sprayed in time during the turning-over process, and the bacterial suspension is made into bacterial suspension and fermented by bacterial suspension. After being used as a bactericide, the compost was mixed in equal proportion and added to the compost. Water and temperature were controlled and placed for 72 hours. The rhizosphere growth promoting bacteria, fungicides and organic fertilizers of the giant fungus grass provided by the invention can significantly promote the growth of plants and improve the yield and quality.

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
巨菌草根際促生菌及其應(yīng)用
本專(zhuān)利技術(shù)涉及農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，具體涉及巨菌草根際促生菌及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
目前，在最早研發(fā)的產(chǎn)品根瘤菌劑已在全世界范圍推廣應(yīng)用，至少有70多個(gè)國(guó)家研究、生產(chǎn)和應(yīng)用。隨著研究的發(fā)展，固氮細(xì)菌、溶磷細(xì)菌等研究工作也在不斷地深入，隨著東歐等一些國(guó)家的科研人員對(duì)固氮菌肥料和溶磷細(xì)菌肥料的研究和應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其促生的主要機(jī)制是這些促生菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生促進(jìn)植物生產(chǎn)的活性物質(zhì)。而如今我國(guó)的微生物肥料研制單位相繼推出聯(lián)合固氮菌肥、硅酸鹽菌劑、有機(jī)物料腐熟劑等適于農(nóng)業(yè)發(fā)展需要的新品種，它們能夠在農(nóng)業(yè)中可持續(xù)發(fā)展，減少化肥的使用、促使農(nóng)作物廢棄物開(kāi)發(fā)利用，對(duì)保護(hù)環(huán)境以及提高農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)和食品安全方面有重要的意義。孫淑榮等研究報(bào)道接種植物促生菌(PGPR)復(fù)合菌劑進(jìn)行試驗(yàn)，可使玉米較對(duì)照平均增產(chǎn)11.01％，增產(chǎn)幅度為7.35％～15.26％，并可替代部分的化肥。毛露甜等在蔬菜，崔美華等在水稻，李景慧等在棉花方面的研究表明，使用菌肥可提高這些作物的產(chǎn)量，對(duì)其生長(zhǎng)有益。本專(zhuān)利技術(shù)主要取材為巨菌草，它在溫度適宜地區(qū)為多年生植物，植株高大，抗逆性強(qiáng)，產(chǎn)量高，蛋白和糖分含量高，直立、叢生，根系發(fā)達(dá)，較強(qiáng)的分蘗能力，其創(chuàng)新點(diǎn)旨在從巨菌草根際篩選固氮菌、溶磷菌和產(chǎn)IAA菌，形成既能加快吸收土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的菌劑，又能補(bǔ)充氮磷的復(fù)合生物有機(jī)肥。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本專(zhuān)利技術(shù)提供了巨菌草根際促生菌及其應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)提供了巨菌草促生菌及其菌劑和生物有機(jī)肥，其對(duì)作物根際區(qū)域及根圍具有促進(jìn)生長(zhǎng)的積極影響，揭示出其在作物中的應(yīng)用效果及作用機(jī)理，解決了陜北地區(qū)的生物有機(jī)肥缺口，并為陜北地區(qū)復(fù)合生物肥料的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供一種新思路。本專(zhuān)利技術(shù)提供的巨菌草根際促生菌及菌劑和有機(jī)肥，能顯著地促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)；菌劑采用多菌株混接的方法，其促進(jìn)植物生長(zhǎng)的效果更好；巨菌草生物有機(jī)肥利用了巨菌草以及禽畜糞便作為載體，其中豐富的有機(jī)物含量，以及巨菌草根際促生菌，使其促生長(zhǎng)效果更好；有機(jī)肥15天就可以制作完成，與市面上其他有機(jī)肥比較大大縮短了發(fā)酵和制備時(shí)間。本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案：巨菌草根際促生菌，包括溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮產(chǎn)IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷產(chǎn)IAA菌株YB-07和溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB-09中的一種或多種；巨菌草樣品取自于全國(guó)各地菌草種殖示范基地，取巨菌草根系，用無(wú)菌ddH2O洗滌，切成小塊，稱(chēng)取1.5cm根段進(jìn)行表面消毒，將截取的植物樣品的根部清洗干凈，用吸水紙吸干，75％酒精浸泡2-3min，無(wú)菌ddH2O洗滌3次后，再用5-20％NaClO溶液消毒表面5-10min，最后用無(wú)菌水繼續(xù)洗滌3次；另取巨菌草根際土壤，與無(wú)菌ddH2O混合搖勻，按8個(gè)濃度梯度，10-2～10–9g/mL，涂于培養(yǎng)基上，各設(shè)重復(fù)3次，所有平板在28℃±2℃下培養(yǎng)72h，劃線分離純化后，得到根際土壤中的促生菌，分別挑選不同形狀的菌落，編號(hào)，保存，檢測(cè)；溶磷細(xì)菌的篩選及分離純化：取細(xì)菌懸液在溶磷細(xì)菌培養(yǎng)基上涂布，表面消毒后取根，均勻截取1.5cm，放入溶磷細(xì)菌培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基均以28℃±2℃培養(yǎng)3-5d，分別挑選較大的透明環(huán)菌株，分離純化，多次傳代培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行保存；溶磷細(xì)菌的促生能力的測(cè)定：用鉬藍(lán)比色法測(cè)定處理液中的磷含量，取50μg/mL的磷標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分別置于20mL具塞試管中，分別加蒸餾水至6mL，再加入1mol·L-1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL鐵-鉬酸試劑，混勻；靜置15min后，用比色計(jì)在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；用所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測(cè)出的吸光度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣品溶液的磷含量；固氮菌的篩選及分離純化：分別稱(chēng)取巨菌草樣品根5.0g，用無(wú)菌水沖洗干凈，進(jìn)行表面滅菌，步驟如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)無(wú)菌水漂洗1min；3)2％次氯酸鈉浸泡10min，無(wú)菌水漂洗三次，然后用無(wú)菌剪刀剪成0.5cm的小塊，放在阿須貝(Ashby)無(wú)氮培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)直至組織塊周?chē)L(zhǎng)出菌苔，用無(wú)菌水將菌苔清洗下來(lái)，梯度稀釋至10-5，取10-3，10-4，10-5稀釋度的菌溶液100μL涂至阿須貝固體培養(yǎng)基，28℃溫箱中培養(yǎng)，最終挑選出生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行保存；固氮菌的促生能力的測(cè)定：將待測(cè)菌株接入Ashby液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，在620nm處測(cè)其OD值，比較OD值的大小，初步確認(rèn)各菌株固氮能力的大小，另將待測(cè)菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培養(yǎng)液的試管中，28℃±2℃靜置培養(yǎng)3d，在每個(gè)試管中加入0.5mLNessler’s試劑，出現(xiàn)黃褐色沉淀的結(jié)果則為產(chǎn)NH3陽(yáng)性反應(yīng)；產(chǎn)IAA菌分離純化及促生能力的測(cè)定：將每株菌株在IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，取2mL培養(yǎng)液體，10000r/min離心15min，并且向每1mL上清液中加入0.5mLSalkowski試劑，并且在暗室溫下顯色1h后在530nm處測(cè)量OD值；以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，并以標(biāo)品IAA對(duì)應(yīng)的光密度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA的產(chǎn)量；按上述方法獲得的促生能力強(qiáng)的10個(gè)菌種按其特征分別編號(hào)為：溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮產(chǎn)IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷產(chǎn)IAA菌株YB-07和溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB-09。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了巨菌草根際促生菌在制備促進(jìn)植物生長(zhǎng)的制品中的用途。進(jìn)一步的，所述促進(jìn)植物生長(zhǎng)的制品為微生物菌肥。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了一種植物促生菌劑，包括前面所述的巨菌草根際促生菌。進(jìn)一步的，所述巨菌草根際促生菌由溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02和固氮產(chǎn)IAA菌株N-01組成。進(jìn)一步的，所述巨菌草根際促生菌由溶磷產(chǎn)IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10組成。本專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種巨菌草生物有機(jī)肥，包括前面所述的巨菌草根際促生菌和組分A，所述組分A包括巨菌草秸稈、新鮮牛糞、新鮮羊糞、新鮮雞糞和生物有機(jī)腐熟劑。進(jìn)一步的，所述巨菌草根際促生菌由溶磷產(chǎn)IAA菌株YB-07、固氮菌株YB-08、溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB-09和溶磷菌株-10組成。進(jìn)一步的，按質(zhì)量比，所述巨菌草根際促生菌為0.1-0.3％；所述組分A中巨菌草秸稈為45-55％、新鮮牛糞為10-20％、新鮮羊糞為10-20％、新鮮雞糞為10-20％和生物有機(jī)腐熟劑為2-10％。本專(zhuān)利技術(shù)還公開(kāi)了一種制備前面所述的巨菌草生物有機(jī)肥的方法，包括：(1)將新鮮牛糞、新鮮羊糞、新鮮雞糞、粉碎的水份質(zhì)量比為2-15％的巨菌草秸稈進(jìn)行初步混合，混合后物料的含水量維持在55-65％，即拌好后，用手抓一把，捏在手中緊握，手指縫中有水印但以水不往下滴為適；(2)在干燥、通風(fēng)的地方開(kāi)始堆積發(fā)酵；第3天，堆肥中肥料會(huì)從20℃升到50℃；采用高溫干發(fā)酵，發(fā)酵溫度在50-60℃，因此在50℃開(kāi)始翻堆，每天一次，如堆溫超過(guò)65℃，再翻堆，12h翻一次，以供應(yīng)氧氣、散本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.巨菌草根際促生菌，其特征在于，包括溶磷固氮菌株NP?01、溶磷固氮菌株NP?02、固氮產(chǎn)IAA菌株N?01、固氮菌株N?02、固氮菌株N?03、固氮菌株YB?08、溶磷菌株N?06、溶磷菌株YB?10、溶磷產(chǎn)IAA菌株YB?07和溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB?09中的一種或多種；巨菌草樣品取自于全國(guó)各地菌草種殖示范基地，取巨菌草根系，用無(wú)菌ddH2O洗滌，切成小塊，稱(chēng)取1.5cm根段進(jìn)行表面消毒，將截取的植物樣品的根部清洗干凈，用吸水紙吸干，75％酒精浸泡2?3min，無(wú)菌ddH2O洗滌3次后，再用5?20％NaClO溶液消毒表面5?10min，最后用無(wú)菌水繼續(xù)洗滌3次；另取巨菌草根際土壤，與無(wú)菌ddH2O混合搖勻，按8個(gè)濃度梯度，10?2～10–9g/mL，涂于培養(yǎng)基上，各設(shè)重復(fù)3次，所有平板在28℃±2℃下培養(yǎng)72h，劃線分離純化后，得到根際土壤中的促生菌，分別挑選不同形狀的菌落，編號(hào)，保存，檢測(cè)；溶磷細(xì)菌的篩選及分離純化：取細(xì)菌懸液在溶磷細(xì)菌培養(yǎng)基上涂布，表面消毒后取根，均勻截取1.5cm，放入溶磷細(xì)菌培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基均以28℃±2℃培養(yǎng)3?5d，分別挑選較大的透明環(huán)菌株，分離純化，多次傳代培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行保存；溶磷細(xì)菌的促生能力的測(cè)定：用鉬藍(lán)比色法測(cè)定處理液中的磷含量，取50μg/mL的磷標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分別置于20mL具塞試管中，分別加蒸餾水至6mL，再加入1mol·L?1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL鐵?鉬酸試劑，混勻；靜置15min后，用比色計(jì)在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；用所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測(cè)出的吸光度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣品溶液的磷含量；固氮菌的篩選及分離純化：分別稱(chēng)取巨菌草樣品根5.0g，用無(wú)菌水沖洗干凈，進(jìn)行表面滅菌，步驟如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)無(wú)菌水漂洗1min；3)2％次氯酸鈉浸泡10min，無(wú)菌水漂洗三次，然后用無(wú)菌剪刀剪成0.5cm的小塊，放在阿須貝(Ashby)無(wú)氮培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)直至組織塊周?chē)L(zhǎng)出菌苔，用無(wú)菌水將菌苔清洗下來(lái)，梯度稀釋至10?5，取10?3，10?4，10?5稀釋度的菌溶液100μL涂至阿須貝固體培養(yǎng)基，28℃溫箱中培養(yǎng)，最終挑選出生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行保存；固氮菌的促生能力的測(cè)定：將待測(cè)菌株接入Ashby液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，在620nm處測(cè)其OD值，比較OD值的大小，初步確認(rèn)各菌株固氮能力的大小，另將待測(cè)菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培養(yǎng)液的試管中，28℃±2℃靜置培養(yǎng)3d，在每個(gè)試管中加入0.5mLNessler’s試劑，出現(xiàn)黃褐色沉淀的結(jié)果則為產(chǎn)NH3陽(yáng)性反應(yīng)；產(chǎn)IAA菌分離純化及促生能力的測(cè)定：將每株菌株在IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，取2mL培養(yǎng)液體，10000r/min離心15min，并且向每1mL上清液中加入0.5mLSalkowski試劑，并且在暗室溫下顯色1h后在530nm處測(cè)量OD值；以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，并以標(biāo)品IAA對(duì)應(yīng)的光密度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA的產(chǎn)量；按上述方法獲得的促生能力強(qiáng)的10個(gè)菌種按其特征分別編號(hào)為：溶磷固氮菌株NP?01、溶磷固氮菌株NP?02、固氮產(chǎn)IAA菌株N?01、固氮菌株N?02、固氮菌株N?03、固氮菌株YB?08、溶磷菌株N?06、溶磷菌株YB?10、溶磷產(chǎn)IAA菌株YB?07和溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB?09。...

【技術(shù)特征摘要】
1.巨菌草根際促生菌，其特征在于，包括溶磷固氮菌株NP-01、溶磷固氮菌株NP-02、固氮產(chǎn)IAA菌株N-01、固氮菌株N-02、固氮菌株N-03、固氮菌株YB-08、溶磷菌株N-06、溶磷菌株YB-10、溶磷產(chǎn)IAA菌株YB-07和溶磷固氮產(chǎn)IAA菌株YB-09中的一種或多種；巨菌草樣品取自于全國(guó)各地菌草種殖示范基地，取巨菌草根系，用無(wú)菌ddH2O洗滌，切成小塊，稱(chēng)取1.5cm根段進(jìn)行表面消毒，將截取的植物樣品的根部清洗干凈，用吸水紙吸干，75％酒精浸泡2-3min，無(wú)菌ddH2O洗滌3次后，再用5-20％NaClO溶液消毒表面5-10min，最后用無(wú)菌水繼續(xù)洗滌3次；另取巨菌草根際土壤，與無(wú)菌ddH2O混合搖勻，按8個(gè)濃度梯度，10-2～10–9g/mL，涂于培養(yǎng)基上，各設(shè)重復(fù)3次，所有平板在28℃±2℃下培養(yǎng)72h，劃線分離純化后，得到根際土壤中的促生菌，分別挑選不同形狀的菌落，編號(hào)，保存，檢測(cè)；溶磷細(xì)菌的篩選及分離純化：取細(xì)菌懸液在溶磷細(xì)菌培養(yǎng)基上涂布，表面消毒后取根，均勻截取1.5cm，放入溶磷細(xì)菌培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基均以28℃±2℃培養(yǎng)3-5d，分別挑選較大的透明環(huán)菌株，分離純化，多次傳代培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行保存；溶磷細(xì)菌的促生能力的測(cè)定：用鉬藍(lán)比色法測(cè)定處理液中的磷含量，取50μg/mL的磷標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分別置于20mL具塞試管中，分別加蒸餾水至6mL，再加入1mol·L-1的硫酸溶液2.0mL，2.0mL鐵-鉬酸試劑，混勻；靜置15min后，用比色計(jì)在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度；用所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以測(cè)出的吸光度通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣品溶液的磷含量；固氮菌的篩選及分離純化：分別稱(chēng)取巨菌草樣品根5.0g，用無(wú)菌水沖洗干凈，進(jìn)行表面滅菌，步驟如下：1)在70％乙醇浸泡1min；2)無(wú)菌水漂洗1min；3)2％次氯酸鈉浸泡10min，無(wú)菌水漂洗三次，然后用無(wú)菌剪刀剪成0.5cm的小塊，放在阿須貝(Ashby)無(wú)氮培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)直至組織塊周?chē)L(zhǎng)出菌苔，用無(wú)菌水將菌苔清洗下來(lái)，梯度稀釋至10-5，取10-3，10-4，10-5稀釋度的菌溶液100μL涂至阿須貝固體培養(yǎng)基，28℃溫箱中培養(yǎng)，最終挑選出生長(zhǎng)較好的菌株進(jìn)行保存；固氮菌的促生能力的測(cè)定：將待測(cè)菌株接入Ashby液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，在620nm處測(cè)其OD值，比較OD值的大小，初步確認(rèn)各菌株固氮能力的大小，另將待測(cè)菌株接入盛有蛋白胨水(10g/L)培養(yǎng)液的試管中，28℃±2℃靜置培養(yǎng)3d，在每個(gè)試管中加入0.5mLNessler’s試劑，出現(xiàn)黃褐色沉淀的結(jié)果則為產(chǎn)NH3陽(yáng)性反應(yīng)；產(chǎn)IAA菌分離純化及促生能力的測(cè)定：將每株菌株在IAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d，取2mL培養(yǎng)液體，10000r/min...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：鄧振山，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：延安大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：陜西,61