一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法技術

本發明專利技術公開了一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法，屬于農業的大白菜育種與應用技術領域。它首先提取供試品種的DNA，然后用如序列表SEQ?ID?No.1～58所示的29對核心SSR引物分別對供試品種DNA進行PCR擴增；PCR產物經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測或者五色熒光毛細管電泳檢測構建大白菜品種的SSR指紋圖譜。本發明專利技術建立了快速準確、經濟簡便、穩定可靠的大白菜DNA指紋鑒定標準實驗體系，并在此基礎上開發了一種適用于大白菜品種鑒定DNA指紋檢測的方法。本發明專利技術利用毛細管電泳方法進行大白菜品種鑒定，在時間上充分提高了試驗效率，具有快速、準確、操作方便等優勢，并且鑒定結果不受環境影響。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法，屬于農業的大白菜育種與應用

技術介紹
大白菜(B.campestris L.ssp.Pekinensis (Lour).0lsson,染色體組 AA，2n=2x=20)起源于中國，是最具中國特色、分布最廣、種植面積最大的重要蔬菜作物。大白菜在中國的種植面積約占蔬菜播種面積的9% 15%，并且先后傳入日本、韓國、朝鮮等國家。由于大白菜在中國及東亞國家的蔬菜生產和消費中占有舉足輕重的地位，因此對商用種子品種的鑒別尤為重要。目前我國對大白菜品種進行鑒定主要方法是按照GB/T 19557.5-2004《植物新品種特異性、一致性和穩定性測試指南大白菜》進行田間測定來鑒定的。這種方法存在的主要問題是運用田間 測定，鑒定結果易受環境因素的影響，也常出現不同測試人員對某些性狀的認識存在偏差，導致代碼判定結果不一致的問題。同時田間測定周期長，不能及時、快捷地為新品種侵權案件提供鑒定依據。測試性狀多、工作量大，無法適用大量品種的測試需求。利用分子標記技術建立DNA指紋圖譜(fingerprint)是鑒別品種、品系的有力工具。品種DNA指紋數據庫的構建在白菜品種純度及真實性鑒定、品種權登記保護、區試及審定品種質量監控等方面具有重要應用價值，對理清我國白菜種質的親緣關系、雜種優勢群劃分、種質創新及新品種選育具有重要指導意義。目前用于繪制植物DNA指紋圖譜的標記技術主要有 RAPD、RFLP、AFLP、SSR 等。簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)也叫微衛星(Microsatellites),是第二代基于PCR技術的分子標記技術。與其它分子標記相比，SSR標記具有多態信息含量高、共顯性遺傳、技術簡單、重復性好、特異性強等特點，已被廣泛應用于植物遺傳研究和育種實踐中。目前，SSR標記也已經應用于大白菜、水稻、小麥、大麥、玉米等作物的指紋圖譜構建、品種鑒定和遺傳多樣性分析。
技術實現思路
本專利技術的目的在于:針對目前大白菜品種的鑒定只能在大田里進行，易受環境影響且工作量大等一系列問題，提供一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法，利用SSR指紋圖譜進打品種鑒定。本專利技術的目的是這樣實現的:一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法，包括提取供試品種DNA、用熒光標記SSR引物進行PCR擴增，電泳檢測和指紋圖譜構建，其特征在于:所述的熒光標記SSR引物包括29對核心SSR引物，分別是cnu_ml39a、nia_m086a、nia_m098a、nia_ml38a、cnu_m046a、nia_ml21a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_mlOla、cnu_m252a、Nal0_D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_ml49a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_ml82a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID N0.1 58所示。具體步驟如下:( I)提取供試品種的DNA ；(2 )用29對核心SSR引物分別對供試品種DNA進行PCR擴增。PCR擴增采用25“1^的反應體積，含(1見13 0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4ymol/L，Taq DNA聚合酶1.0單位，I XPCR緩沖液(不含Mg2+)，MgCl2L 5mmol/L，樣品DNA 10_40ng。反應程序采用 TouchdownPCR:94°C預變性 4min ;94°C變性 45s，65°C退火 45s，72°C延伸 45s，每循環降1°C，共15個循環；94°C變性45s，50°C退火30s，72°C延伸45s，共30個循環；72°C延伸10min，4°C 保存。(3) PCR產物經電泳檢測構建大白菜品種的SSR指紋圖譜。a.變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產物，60W恒功率電泳1.5h，銀染顯色；以pBR322DNA/MspI為DNA分子量標準，將每一位點待測樣品和相應的參照品種擴增片段的帶型和移動位置進行比較，根據參照品種的移動位置和擴增片段大小，確定待測樣品該位點的等位變異大小，純合位點的等位變異記錄為X/X，雜合位點的等位變異記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異片段大小，小片段在前，大片段在后；無效等位變異記錄為0/0 ;多個位點的數據整合在一起形成不同大白菜品種的SSR指紋圖譜。b.五色熒光毛細管電泳檢測將6-FAM (藍色)和HEX (綠色)熒光標記的PCR產物用超純水稀釋30倍，TAMRA(黑色)和ROX (紅色)熒光標記的PCR產物稀釋10倍；分別取等體積的上述4種稀釋后溶液混合形成混合液^lyL混合液加入0.1 μ L LIZ500分子量內標和8.9 μ L去離子甲酰胺加入到DNA分析儀專用深孔板孔中；然后將其在PCR儀上95°C變性5min，取出，立即置于碎冰上,冷卻IOmin以上；瞬時離心IOs后置放到DNA分析儀上進行毛細管電泳檢測,用GENEMAPPER進行圖像分析和數據采集；以pBR322DNA/MspI為DNA分子量標準，將每一位點待測樣品和相應的參照品種擴增片段的帶型和移動位置進行比較，根據參照品種的移動位置和擴增片段大小，確定待測樣品該位點的等位變異大小，純合位點的等位變異記錄為X/X，雜合位點的等位變異記錄為X/Y，其中X、Y為該位點上兩個不同的等位變異片段大小，小片段在前，大片段在后；無效等位變異記錄為0/0 ;多個位點的數據整合在一起形成不同大白菜品種的SSR指紋圖譜形。除待測樣品外，每個SSR位點還應同時包括3 4個參照品種的擴增產物。本專利技術所構建的SSR指紋圖譜如表3所示。利用SSR指紋圖譜進行大白菜品種鑒別；依據29對核心熒光標記SSR引物的檢測結果進行判定:品種間差異位點數> 3為不同品種；品種間差異位點數〈3為近似品種。本專利技術的有益效果是:本專利技術建立了快速準確、經濟簡便、穩定可靠的大白菜DNA指紋鑒定標準實驗體系，并在此基礎上開發了一種適用于大白菜品種鑒定DNA指紋檢測的方法。本專利技術利用毛細管電泳方法進行大白菜品種鑒定，在時間上充分提高了試驗效率，具有快速、準確、操作方便等優勢，并且鑒定結果不受環境影響。附圖說明圖1是50份大白菜品種基于29對核心SSR引物的品種聚類圖。具體實施例方式實施例1I) DNA提取表I50份供試品種權利要求1.一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法，包括提取供試品種DNA、用熒光標記SSR引物進行PCR擴增、電泳檢測和指紋圖譜構建，其特征在于:所述的熒光標記SSR引物包括29對核心 SSR 引物，分別是 cnu_ml39a、nia_m086a、nia_m098a、nia_ml38a、cnu_m046a、nia_ml21a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_ml01a、cnu_m252a、Nal0_D09、cnu_m289a、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種大白菜SSR指紋圖譜構建方法，包括提取供試品種DNA、用熒光標記SSR引物進行PCR擴增、電泳檢測和指紋圖譜構建，其特征在于：所述的熒光標記SSR引物包括29對核心SSR引物，分別是cnu_m139a、nia_m086a、nia_m098a、nia_m138a、cnu_m046a、nia_m121a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_m101a、cnu_m252a、Na10?D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_m149a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_m182a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ?ID?No.1～58所示；所述電泳檢測為五色熒光毛細管電泳檢測或者變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李汝玉，張晗，段麗麗，王東建，孫加梅，李華，鄭永勝，王雪梅，
申請(專利權)人：山東省農業科學院作物研究所，
類型：發明
國別省市：