本發明專利技術公開了白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應用，屬于分子生物學和免疫學領域。本發明專利技術是將分子生物學的聚合酶鏈式反應技術和免疫層析技術進行結合，實現對白色念珠菌的快速檢測。本發明專利技術試劑盒包括PCR擴增及試紙條檢測共二部分。其中通過對引物進行特定修飾，并在試紙條制備中選擇相應的包被物和標記物，反應過程中形成一個特異的復合物，實現分子生物學技術和免疫層析技術的結合，達到對白色念珠菌特異擴增產物的檢測，與傳統生化方法相比大大節省了檢測時間，簡化操作步驟，以達到快速、高效、準確的檢測和篩選目的。在臨床檢測和篩選白色念珠菌的過程中發揮重要作用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學和免疫學領域，涉及快速檢測白色念珠菌的試劑盒及方法和應用。
技術介紹
白色念珠菌(Candida albicans)是念珠菌屬(假絲酵母屬)中最為常見的種。也是臨床上淺部/深部真菌病中發病率最高的念珠菌病的重要病原菌。由于該菌多侵犯已患有嚴重疾病機體免疫力低下的病人，以及接受器官移植，實施心臟、胃腸道手術需行插管、尿管、導管的外科病人，對生命威脅極大，為及早發現與診斷念珠菌感染，快速、簡便、特異及準確達到臨床分離和鑒定念珠菌的方法一直受到國內外的廣泛關注。隨著免疫受損或低下人群的不斷擴大，機會性念珠菌病繼續增多，迄今仍是醫學真菌領域研究的熱點。目前國內外白色念珠菌主要的檢測方法有傳統的微生物檢測方法和分子生物學檢測方法。微生物方法檢測白色念珠菌主要用到科瑪嘉顯色培養基進行分離鑒別，要求檢測人員有較豐富的經驗，進口的培養基檢測成本也高。分子生物學檢測主要使用PCR及RT-PCR等方法，普通的PCR技術其擴增產物大多通過凝膠電泳判斷擴增結果，該方法中的致癌物質不僅對環境和操作人員有很大的危害，而且要求檢測人員具備熟練的操作技巧，點樣時操作誤差會使樣品漂移造成結果不準確，不適合進行大量樣本的檢測分析工作；RT-PCR方法需要購買高端的儀器設備，并且試劑價格昂貴，這些都給檢測帶來了巨大的成本壓力。
技術實現思路
本專利技術解決的技術問題是提供白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應用；專利技術主要目的在于克服傳統的微生物檢測方法存在檢測時間長、步驟繁瑣等缺陷，提供一種更加快速、簡捷、安全的檢測試劑盒及其檢測方法。本專利技術設計試劑盒即可以保證PCR技術的靈敏度和特異性，還保留了免疫層析技術所具備的高效、便捷、低成本等特點。所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，包括PCR反應液、樣品稀釋液、陰性對照、陽性對照和試紙條，所述試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成。所述結合墊上包被膠體金顆粒標記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線；所述PCR反應液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5 ’ TTGGTGGTGGTAGACATAGA 3’，下游引物R為5’ TCAGAACACTGAATCGAAAG 3’ ；所述上游引物F標記生物素，下游引物R標記地高辛。所述結合墊上包被的膠體金顆粒粒徑為25nm，ImL膠體金顆粒標記8.4 μ g鼠抗地高辛抗體，形成的膠體金-抗體復合物在結合點墊上的包被量為2mL/30cm。所述硝酸纖維素膜上檢測線包被親和素濃度為0.5mg/mL,包被量為I μ L/cm ;控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL，包被量為I μ L/cm。PCR反應液組成如下:23 μ L反應體系包括以下組分權利要求1.一種白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，包括PCR反應液和試紙條，所述試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成；其特征在于試劑盒還包括PCR反應液，PCR反應液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5 ’ TTGGTGGTGGTAGACATAGA3’，下游引物 R 為 5’ TCAGAACACTGAATCGAAAG3’ ；所述上游引物 F5 ’端標記生物素，下游引物R5’端標記地高辛；所述結合墊上包被膠體金顆粒標記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線。2.如權利要求1所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述PCR反應液組成如下:23 μ L反應體系包括以下組分3.如權利要求1或2所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，所述PCR反應液中引物F5’端標記的生物素與硝酸纖維素膜上親和素結合；引物R5’端標記的地高辛與結合墊上膠體金顆粒標記的鼠抗地高辛抗體結合。4.如權利要求1或3所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述結合墊上包被膠體金顆粒粒徑為25nm, ImL膠體金顆粒標記8.4 μ g鼠抗地高辛抗體,形成的膠體金-抗體復合物在結合點墊上的包被量為2mL/30cm。5.如權利要求1所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述硝酸纖維素膜上檢測線包被親和素濃度為0.5mg/mL，包被量為I μ L/cm ;控制線上包被羊抗鼠抗體濃度為lmg/mL,包被量為I μ L/cm。6.如權利要求1-5所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，其特征在于所述試紙條外部設置塑料卡盒，塑料卡盒上依次設置凹孔和觀測口，所述試紙條的樣品墊放置于凹孔對應處，硝酸纖維素膜上設置的質控線和檢測線在觀測口對應處。7.如權利要求1-6中任一權利要求所述白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒的檢測方法，包括如下步驟: ` 1)取出含有PCR反應液的反應管，待溶化后2000轉/分離心30秒； `2)向反應液管中加入2μL樣品DNA,混勻； `3)將上述反應管置于普通PCR儀中，95°C變性3min后，95°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸45s，進行30個循環，之后72°C延伸lOmin，完成PCR擴增； ` 4)將上述10μ L的擴增產物與90 μ L的樣品稀釋液進行混合； ` 5)取出試紙條平放于水平桌面上，將上述混合液加在試紙條樣品孔中； ` 6)反應IOmin后，根據試紙條層析情況判斷檢測結果，完成樣本檢測； 結果判定:出現兩條紅線，一條檢測線，一條質控線，表示樣品中存在白色念珠菌；僅出現一條紅線(在質控線)，則樣品中不存在白色念珠菌。8.一種白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒在檢測樣品中白色念珠菌中的應用。全文摘要本專利技術公開了白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒及其檢測方法和應用，屬于分子生物學和免疫學領域。本專利技術是將分子生物學的聚合酶鏈式反應技術和免疫層析技術進行結合，實現對白色念珠菌的快速檢測。本專利技術試劑盒包括PCR擴增及試紙條檢測共二部分。其中通過對引物進行特定修飾，并在試紙條制備中選擇相應的包被物和標記物，反應過程中形成一個特異的復合物，實現分子生物學技術和免疫層析技術的結合，達到對白色念珠菌特異擴增產物的檢測，與傳統生化方法相比大大節省了檢測時間，簡化操作步驟，以達到快速、高效、準確的檢測和篩選目的。在臨床檢測和篩選白色念珠菌的過程中發揮重要作用。文檔編號C12Q1/68GK103194536SQ20131006830公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日專利技術者何艷玲, 王麗麗, 劉沛, 于重楠 申請人:北京陸橋技術有限責任公司本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種白色念珠菌核酸層析檢測試劑盒，包括PCR反應液和試紙條，所述試紙條由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊順次搭接黏貼在底襯上組成；其特征在于試劑盒還包括PCR反應液，PCR反應液中含有上游引物F和下游引物R，上游引物F為5’TTGGTGGTGGTAGACATAGA3“，下游引物R為5“TCAGAACACTGAATCGAAAG3“；所述上游引物F5’端標記生物素，下游引物R5’端標記地高辛；所述結合墊上包被膠體金顆粒標記的鼠抗地高辛抗體，硝酸纖維素膜上有包被親和素的檢測線和包被羊抗鼠抗體的控制線。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：何艷玲，王麗麗，劉沛，于重楠，
申請(專利權)人：北京陸橋技術有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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