本發明專利技術公開了鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對SR-5×16。本發明專利技術提供的鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的方法，包括如下步驟：分別以待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ?ID?No.1和2所示的PCR引物對進行PCR擴增，檢測所得到的PCR產物的大小，如果所述待鑒別的兩株原生質體單核體的PCR產物均含有500bp-800bp的DNA片段或均不含有500bp-800bp的DNA片段，該兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型相同；如果所述待鑒別的兩株原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物含有500bp-800bp的DNA片段，另一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物不含有500bp-800bp的DNA片段，該兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型不同。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對 SR-5X16。
技術介紹
營養不親和系統是一種識別異己的遺傳系統，在多數真菌中，該系統能引起遺傳上明顯不同的個體在交接區產生特征性的體細胞不親和性(戚元成等，中國栽培糙皮側耳品種體細胞不親和性實驗與RAro分析結果的比較.菌物學報，2010，29 (3))反應，體細胞不親和性反應的強度因個體不同而異。在真菌中，營養不親和又稱為體細胞不親和或異核體不親和，它的作用在于防止同一種內交配型不同的個體或營養不親和位點上基因不同的個體間的融合，以保持個體遺傳上的穩定性。交配型是根據交配因子的個體間能否完成交配結合而確定的結合類型(中國標準出版社第一編輯室，中國農業標準匯編(食用菌卷).中國標準出版社，2010)。在真菌的有性生殖和營養生長過程中都存在一個自己或異己識別的機制或系統。有性生殖階段靠交配型因子識別；而營養生長階段的識別是靠異核體不親和系統來進行的。異核體不親和性是普遍存在于真菌中的一種生物學現象，在子囊菌、擔子菌、接合菌等真菌中是一種普遍存在的現象。在異核體形成過程中，非己識別系統通過一系列蛋白因子的相互作用最終導致遺傳背景不同的核不能形成穩定的異核體，也就是所謂的異核不親和性。異核體不親和性是一個受基因調控的過程并且往往異核體不親和性的菌絲體會死亡。異核菌絲體在原生質體制備過程中出現單核原生質體的現象。這些單核原生質體經過再生培養和遺傳篩選成為原生質體單核體，由于原生質體單核體是直接來源于營養菌絲，沒有經歷過減數分裂的無性后代，它為食用菌的遺傳和育種研究提供了一種十分重要的基礎材料。原生質體單核體的雜交育種方式是把兩個分別來自雙核親本的原生質體單核體兩兩接入同一 PDA平板 ，對峙培養進行雜交。在雜交過程中，兩個原生質體單核體的細胞質進行重組，形成一個異質異核的雜交后代。這一方法的主要特點是，根據親本性狀不易在原生質體單核體中分散和稀釋，在育種程序中可以從一個比較小的變異范圍內去選擇具有親本性狀的不育單核體，有效地克服了傳統育種過程中由孢子單核體遺傳多樣性所造成的親本性狀分散和選材困難的障礙，減少了篩選雜交后代的工作量。同時，由于原生質體單核體是在實驗室條件下獲得的，無季節性限制，因此縮短了育種時間。花臉蘑Lepista sordida (Fr) Sing 屬于擔子菌亞門(Basidiomycomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、傘菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、香蘑屬(Lepista)。該菌營養豐富，具有一定的藥用功效。在中國主要分布于貴州、黑龍江、遼寧、河北、河南、甘肅、青海、四川、新疆、山西、內蒙古和福建等地，是一種名貴的食用菌和藥用菌，人工栽培花臉香蘑還處于小規模試驗階段，野生產量低且稀少，其價格極其昂貴，是一種很有開發潛力的野生菌種。但實際生產中存在產量低，抗蟲能力差，適應溫度范圍窄，子實體易碎，不易運輸、保存等亟待解決的難題。這就要求花臉蘑的遺傳育種相關的基礎研究加大力度，為傳統的遺傳育種奠定堅實的理論基礎和技術支持。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的方法及其專用引物對SR-5X16。本專利技術所提供的鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的PCR引物對，名稱為SR-5X 16，由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的兩條單鏈DNA組成。其中，SEQ ID N0.1由20個脫氧核苷酸組成，SEQ ID N0.2由19個脫氧核苷酸組成。含有PCR引物對SR-5X 16的鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的試劑或試劑盒也屬于本專利技術的保護范圍。所述試劑或試劑盒除PCR引物對SR-5 X 16外，還含有進行PCR和DNA測序的其它常規試劑。本專利技術的實驗證明PCR弓丨物對SR-5 X 16、含有PCR弓丨物對SR-5 X 16的試劑或試劑盒可用于鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型。本專利技術所提供的鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的方法，包括如下步驟:分別以待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對SR-5X 16進行PCR擴增，檢測所得到的PCR產物的大小，根據PCR擴增產物的大小按照下述方法確定所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型:如果所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的PCR產物均含有500bp_800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的PCR產物均為500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同，如果所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的PCR產物均不含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的PCR產物均不為大小是500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同；如果所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物含有500bp-800bp的DNA片段(或所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物為500bp-800bp的DNA片段)，另一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物不含有500bp-800bp的DNA片段(或另一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物不為500bp-800bp的DNA片段)，所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型不同或候選為交配型不同。上述方法中，所述500bp-800bp的DNA片段具體為641bp的DNA片段。在本專利技術的一個實施例中，所述PCR擴增采用的引物退火條件為56°C退火30s。所述PCR擴增中采用的PCR反應溫度程序如下:94°C預變性5min ;94°C變性30s，56°C退火30s, 72°C延伸 40s, 30 個循環；72°C延伸 7min。 上述方法中，兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型相同是指將兩株花臉蘑原生質體單核體在一起對峙培養，兩株花臉蘑原生質體單核體的菌絲交接處無拮抗線，不能產生鎖狀聯合；兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型不同是指將兩株花臉蘑原生質體單核體在一起對峙培養，兩株花臉蘑原生質體單核體的菌絲交接處有拮抗線并產生鎖狀聯合，雜交可育。實驗證明，本專利技術的特異性引物對SR-5X 16對花臉蘑原生質體單核體具有特異性，本專利技術利用PCR引物對SR-5X 16鑒別花臉蘑原生質體單核體間的交配型是否相同的方法與現有的體細胞不親和性實驗方法鑒別花臉蘑原生質體單核體間的交配型是否相同的方法的一致性為100%。本方法縮短了花臉蘑原生質體單核體交配型的鑒別時間并簡化了交配型鑒別的步驟，其準確性和可靠性高。通過原生質體單核化獲得的單核體稱為原生質單核體，與孢子單核體不同，原生質體單核體在原生質體制備過程中從花臉蘑異核菌絲體中直接得到的單核單倍體的無性后代，因此花臉蘑的原生質單核體只有兩種形式的交配型AxBx和AyBy兩對。在常規的雜交育種中，只有交配本文檔來自技高網...
【技術保護點】
鑒別或輔助鑒別花臉蘑原生質體單核體交配型的方法，包括如下步驟：分別以待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的基因組DNA為模板，用由SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對進行PCR擴增，檢測所得到的PCR產物的大小，根據PCR擴增產物的大小按照下述方法確定所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型：如果所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的PCR產物均含有500bp?800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同，如果所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的PCR產物均不含有500bp?800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型相同或候選為交配型相同；如果所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體中的一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物含有500bp?800bp的DNA片段，另一株待鑒別的花臉蘑原生質體單核體的PCR產物不含有500bp?800bp的DNA片段，所述待鑒別的兩株花臉蘑原生質體單核體的交配型不同或候選為交配型不同。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：許峰，劉宇，李登進，趙爽，王守現，王蘭青，耿小麗，
申請(專利權)人：北京市農林科學院，
類型：發明
國別省市：
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