一種從釀酒酵母細胞中高效提取高分子量基因組的方法，包括采用lyticase破壁、蛋白酶k與RNase除去組蛋白和RNA、氯仿抽提、沉淀、溶解。本發(fā)明專利技術從影響釀酒酵母基因組提取的質和量入手，將破壁和去除蛋白、RNA的過程分開，分別采用不同的緩沖液及添加還原劑來保證破壁的效率和除去雜質的效果。在工藝過程上進行了更細致的優(yōu)化，增加了抽提的次數，使基因組更加完整并提高了純度。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物的分子生物學領域，特別提供了。通過該方法提取的基因組可以滿足許多分子生物學分析的需要。
技術介紹
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為低等真核生物,與同屬真核生物的動物和植物細胞在結構上有很多相似性。早在1996年釀酒酵母的基因組測序工作就已完成，是被人們了解最多的微生物之一。釀酒酵母具有易于培養(yǎng)且繁殖迅速的特點，經常被用來作為研究真核生物的工程菌。釀酒酵母被廣泛應用于食品生產和基因工程領域。目前對釀酒酵母的研究已經上升到了分子水平，隨著對其生理機制研究的深入，釀酒酵母的一些功能蛋白的基因經常被用來在其它工程菌中克隆、表達。研究中對于釀酒酵母基因組的需求，無論是在量或質上都大為提高。目前實驗室提取酵母基因組DNA的方法主要有試劑盒法、液氮研磨法、化學試劑法。但這些方法往往只能適用于部分酵母，缺乏通用性，對于釀酒酵母基因組的提取，效果往往不夠理想。由于缺乏專門針釀酒酵母這一特定酵母基因組的提取方法，本專利通過多次優(yōu)化實驗流程和試劑配方，總結出。
技術實現思路
為了解決現有酵母基因組提取方法的不足，本專利技術提供了，包括破壁、去除組蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具體工藝過程如下: 破壁:破解細胞壁與細胞膜是提取基因組DNA的基礎，由于釀酒酵母細胞壁結構比細菌細胞壁更為堅固、厚實，一般的溶菌酶并不能有效的分解釀酒酵母的細胞壁，因此本專利使用Iyticase來破除細胞壁。用500 μ I的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母,加入40 μ 1> 1000U/ml的Iyticase和I μ I β -巰基乙醇，混勻后37°C孵育3h。去除組蛋白和RNA:對破壁后的細胞使用蛋白酶k和RNase去除染色體上的組蛋白和不需要的RNA。8000r/min lmin離心棄上清(加速要慢)，加500 μ ITE緩沖液(ρΗ8.0),混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lU0g/ml RNase，37°C孵育lh。抽提:加入500 μ I平衡酹,顛倒混勻、靜置5min, 8000r/min離心lmmin。移取上層加入250 μ I平衡酚和250 μ I氯仿:異戊醇(24: I)顛倒混勻、靜置5min，加500 μ I氯仿，顛倒混勻、靜置5min,8000r/min離心lmin,取上層水相。沉淀:取上層水相，加入2倍體積無水乙醇，-20°c放置lh。12000r/min離心IOmin。溶解:棄上清并置于超凈臺吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。所述山梨醇緩沖液為:lmol/L，pH 7.5 ；所述TE 緩沖液為:ImoI/LTris.Cl，pH 8.0,0.5mol/L EDTA，0.5mol/L 檸檬酸，力口水至 1000ml ；Lyticase (1000U/ml)蛋白酶 k (200mg/ml) RNase (10g/ml)。本專利技術從影響釀酒酵母基因組提取的質和量入手，將破壁和去除蛋白、RNA的過程分開，分別采用不同的緩沖液及添加還原劑來保證破壁的效率和除去雜質的效果。在工藝過程上進行了更細致的優(yōu)化，增加了抽提的次數，使基因組更加完整并提高了純度，能更好地滿足分子生物學的需求。附圖說明圖1:1、2、3為本方法提取的基因組；4為用蝸牛酶法；5為SDS反復凍融法；M為λ-HindIII digestDNA 分子量標準。具體實施例方式實施例1:挑取釀酒酵母BY4742單菌落培養(yǎng)至OD ^ 3，收集濕重約Ig的新鮮菌體，山梨醇洗漆一次；加入500 μ I的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40 μ lU000U/ml的Iyticase和I μ I β -巰基乙醇，混勻后37°C孵育3h ；8000r/min lmin離心棄上清(加速要慢)，加500 μ I TE緩沖液(ρΗ8.0),混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lUOg/ml RNase，37°C孵育Ih ；加入500 μ I平衡酹,顛倒混勻、靜置5min, 8000r/min離心lmin。移取上層加入250 μ I平衡酚和250 μ I氯仿:異戊醇(24: I)顛倒混勻、靜置5min，加500 μ I氯仿，顛倒混勻、靜置5min,8000r/min離心lmin,取上層水相；加入2倍體積無水乙醇，-20°C放置lh。12000r/min離心IOmin ；棄上清并置于超凈臺吹干，加入50 μ I ddH20溶解DNA。權利要求1.，其特征在于:包括破壁、去除組蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具體工藝過程如下: 破壁:用500 μ I的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μ lU000U/ml的Iyticase和1 μ 1 β -巰基乙醇，混勻后37°C孵育3h。去除組蛋白和RNA:8000r/min Imin離心棄上清(加速要慢)，加500 μ ITE緩沖液(ρΗ8.0)，混勻后加 50 μ 1、10% SDS，加入 10 μ l、200mg/ml 蛋白酶 k，再加入 10μ lU0g/mlRNase，37 °C 孵育 Ih。抽提:加入500 μ 1平衡酹,顛倒混勻、靜置5min,8000r/min離心lmin。移取上層加入。250 μ I平衡酚和250 μ 1氯仿:異戊醇(24: 1)顛倒混勻、靜置5min，加500 μ I氯仿，顛倒混勻、靜置5min,8000r/min離心lmin,取上層水相。沉淀:加入2 倍體積無水乙醇，_20°C放置lh。12000r/min離心lOmin。溶解: 棄上清并置于超凈臺吹干，加入50 μ 1 ddH20溶解DNA。 所述山梨醇緩沖液為:lmol/L, pH 7.5 ； 所述 TE 緩沖液為:lmol/LTris Cl, pH 8.0,0.5mol/L EDTA，0.5mol/L 檸檬酸，加水至1000ml。全文摘要，包括采用lyticase破壁、蛋白酶k與RNase除去組蛋白和RNA、氯仿抽提、沉淀、溶解。本專利技術從影響釀酒酵母基因組提取的質和量入手，將破壁和去除蛋白、RNA的過程分開，分別采用不同的緩沖液及添加還原劑來保證破壁的效率和除去雜質的效果。在工藝過程上進行了更細致的優(yōu)化，增加了抽提的次數，使基因組更加完整并提高了純度。文檔編號C12N15/10GK103194440SQ20121000395公開日2013年7月10日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權日2012年1月9日專利技術者張震宇, 顧春銀, 徐燦, 李忠浩, 楊冬美 申請人:江南大學本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種從釀酒酵母細胞中高效提取高分子量基因組的方法，其特征在于：包括破壁、去除組蛋白和RNA、抽提、沉淀、溶解，具體工藝過程如下：破壁：用500μl的山梨醇緩沖液懸浮釀酒酵母，加入40μl、1000U/ml的lyticase和1μl?β?巰基乙醇，混勻后37℃孵育3h。去除組蛋白和RNA：8000r/min?1min離心棄上清(加速要慢)，加500μlTE緩沖液(pH8.0)，混勻后加50μl、10％SDS，加入10μl、200mg/ml蛋白酶k，再加入10μl、10g/ml?RNase，37℃孵育1h。抽提：加入500μl平衡酚，顛倒混勻、靜置5min，8000r/min離心1min。移取上層加入250μl平衡酚和250μl氯仿∶異戊醇(24∶1)顛倒混勻、靜置5min，加500μl氯仿，顛倒混勻、靜置5min，8000r/min離心1min，取上層水相。沉淀：加入2倍體積無水乙醇，?20℃放置1h。12000r/min離心10min。溶解：棄上清并置于超凈臺吹干，加入50μl?ddH2O溶解DNA。所述山梨醇緩沖液為：1mol/L，pH?7.5；所述TE緩沖液為：1mol/LTris·Cl，pH?8.0，0.5mol/L?EDTA，0.5mol/L檸檬酸，加水至1000ml。...
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：張震宇，顧春銀，徐燦，李忠浩，楊冬美，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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