集成基因代謝和重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法，還提供了利用該方法獲得的一株具有副產(chǎn)物低、高酒精耐性的優(yōu)良工業(yè)釀酒酵母工程菌株及其應(yīng)用；運(yùn)用本發(fā)明專利技術(shù)方法可改良釀酒酵母菌株的糖醇轉(zhuǎn)化率、耐性、發(fā)酵速率等多種生產(chǎn)性能，改良菌株可用于工業(yè)濃醪酒精發(fā)酵生產(chǎn)，減少能耗，降低生產(chǎn)成本；此方法也可用于其它工業(yè)微生物性能的改良。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法。
技術(shù)介紹
酒精濃醪發(fā)酵，簡單來說就是發(fā)酵過程中的高濃度發(fā)酵，具體表現(xiàn)在生產(chǎn)有以下特點(diǎn):1、高酒份；2、高滲透壓；3、高酵母數(shù)。就酒精生產(chǎn)而言，不同原料、不同時期濃醪發(fā)酵的界限存在著明顯的差別；大概區(qū)分如下:淀粉質(zhì)原料:酒精濃度在14 16% (V/V)，糖蜜原料:酒精濃度在10 12% (V/V)0實(shí)現(xiàn)酒精濃醪發(fā)酵技術(shù)，可極大地提高設(shè)備利用率、減少工藝用水、降低蒸煮蒸餾能耗和生產(chǎn)成本，對提高乙醇生產(chǎn)的效率與經(jīng)濟(jì)和社會效益具有重要現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價值。與常規(guī)酒精發(fā)酵相比，釀酒酵母在濃醪發(fā)酵過程中，不僅面臨著更加嚴(yán)峻的環(huán)境脅迫(高滲、高酒精脅迫等)，還會因甘油、乙酸等副產(chǎn)物生成的增多而降低葡萄糖乙醇轉(zhuǎn)化率。因此,為達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)對發(fā)酵速率、乙醇產(chǎn)量和糖醇轉(zhuǎn)化率等技術(shù)指標(biāo)的要求,選育副產(chǎn)物合成低并具有高耐性的工業(yè)釀酒酵母菌株是突破濃醪發(fā)酵技術(shù)瓶頸的關(guān)鍵所在。甘油是釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)乙醇過程中主要的副產(chǎn)物，約消耗4% 10%的總碳源，如這些碳源用于生成乙醇，全球每年無需增加成本即可增產(chǎn)乙醇13億升。目前，對酵母細(xì)胞甘油代謝途徑已研究比較透徹，應(yīng)用基因代謝工程技術(shù)對甘油合成相關(guān)的基因及途徑進(jìn)行修飾和改造，可以有效降低甘油的合成，但改造菌株在發(fā)酵過程中對高糖、高濃度乙醇等脅迫因子耐受性下降，生長緩慢，進(jìn)而引起發(fā)酵速率降低、發(fā)酵周期延長及乙醇產(chǎn)量降低等不良現(xiàn)象。針對一個或少量基因調(diào)控、機(jī)制已知的性狀，基因代謝工程方法是較容易和直接的可行性理性策略，但對于涉及多個基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性狀(如發(fā)酵速率、耐受性等發(fā)酵性狀)，基因代謝工程技術(shù)很難達(dá)到預(yù)期效果，甚至?xí)鹁觋P(guān)鍵性能的退化衰變。目前，已有研究應(yīng)用基于全基因組水平的盲目育種技術(shù)一全基因組重排，有效改良菌株的耐乙酸、耐高濃度乙醇等耐受性，但改造菌株的其他生產(chǎn)性能如糖醇轉(zhuǎn)化率提高并不顯著，而且隨著醪液可發(fā)酵性碳源的增加，副產(chǎn)物合成也增加，極大限制了乙醇產(chǎn)量的提高。綜上所述，應(yīng)用單一的育種手段雖然能夠改良菌株某一方面的性狀，但很難獲得性能全面的優(yōu)良菌株，而且容易導(dǎo)致生產(chǎn)菌株關(guān)鍵性能的退化衰變。要從根本上突破濃醪發(fā)酵技術(shù)瓶頸，獲得性能全面的 優(yōu)良釀酒酵母菌株，還是需要結(jié)合不同的工業(yè)微生物育種策略優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)優(yōu)劣互補(bǔ)，集成創(chuàng)新，更有效、快速地進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)菌株的改良。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的是提供一種集成基因代謝工程與全基因組重排技術(shù)改良菌株多種生產(chǎn)性能的方法。本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是:一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法，所述方法包括:(1)誘導(dǎo)釀酒酵母菌株產(chǎn)孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Yl和交配型α的單倍體菌株Υ2作為出發(fā)菌株；(2)然后分別敲除菌株Yl和菌株Υ2的編碼甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因FPSl，并在FPSl位點(diǎn)整合表達(dá)變鏈球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脫氫酶(GAPN),對單倍體Yl和Y2分別采用GMSlr和Zeolr抗性標(biāo)記篩選，獲得單倍體基因工程菌株:6418^抗性菌株 YFGl (MATa, fpsl Δ::PGKp_gapN)和 Zeor 抗性菌株 YFG2 (MAT a，fpsl Δ::PGKp-gapN)；(3)分別使用紫外和EMS對菌株YFGl和菌株YFG2進(jìn)行誘變，獲得四個突變庫:YFGl紫外誘變庫、YFG1EMS誘變庫、YFG2紫外誘變庫和YFG2EMS誘變庫；(4)以體積濃度8%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進(jìn)行第一輪全基因組重排，用含300 μ g/mL G418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板篩選重排子，誘導(dǎo)重排子產(chǎn)孢破壁后，用體積濃度12%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進(jìn)行第二輪全基因組重排，用含300 μ g/mLG418和50 μ g/mL Zeocin的YPD平板篩選重排子，通過模擬工業(yè)原料的濃醪發(fā)酵測試,獲得低副產(chǎn)物合成、高糖醇轉(zhuǎn)化率和高乙醇產(chǎn)量的工業(yè)釀酒酵母工程菌株。所述甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列GenBank號NP_013057 ;所述變鏈球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脫氫酶(GAPN)的氨基酸序列的GenBank號為AAA91091o所述甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因GenBank號NM_001181863 ;所述變鏈球菌(Streptococcus mutans)的3-憐酸甘油醒脫氧酶(GAPN)的編碼基因GenBank號為L38521。由上述方法獲得的一株低甘油合成、高酒精耐性的工業(yè)釀酒酵母菌株一釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FGl,提議的分類命名為:Saccharomyces cerevisiae FGl(MATa/a fpsl Δ::PGKl_gapN fpsl Δ::PGKl_gapN)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號=CCTCC No:M2011274，保藏日期:2011年8月1曰。所述釀酒酵母CCTCC No:M 2011274可用于微生物工業(yè)濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精。具體為:將釀酒酵母CCTCC No:M 2011274接種至以雙酶法配制的玉米糖化醪發(fā)酵液，30 35°C發(fā)酵60 80h，發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液經(jīng)分離純化獲得酒精。具體的，所述玉米糖化醪發(fā)酵液可按常規(guī)雙酶法配制，本專利技術(shù)中具體如下:取玉米粉，加2 3倍質(zhì)量的水調(diào)漿，攪拌加熱至50 70°C，加入耐高溫α -淀粉酶IOU 30U/g玉米粉，混勻后加熱至80 90°C進(jìn)行糊化液化，100 110°C保溫0.5 2h ;糊化醪冷卻至50 70°C，加入糖化酶100U 300U/g玉米粉，55 60°C糖化0.5 1.0h,即得所述玉米糖化醪發(fā)酵液。本專利技術(shù)的有益效果主要體現(xiàn)在:本專利技術(shù)提供了一株具有副產(chǎn)物低、高酒精耐性的優(yōu)良工業(yè)釀酒酵母工程菌株及其應(yīng)用，以及一種改良工業(yè)菌株多種生產(chǎn)性能的方法——基因代謝工程與全基因組重排聯(lián)用；運(yùn)用此方法可改良釀酒酵母菌株的糖醇轉(zhuǎn)化率、耐性、發(fā)酵速率等多種生產(chǎn)性能，改良菌株可用于工業(yè)濃醪酒精發(fā)酵生產(chǎn)，減少能耗，降低生產(chǎn)成本；此方法也可用于其它工業(yè)微生物性能的改良。附圖說明圖1為G4181抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意圖；圖2為Zeolr抗性的敲除FPSl整合gapN盒示意圖；圖3為全基因組重排流程圖;其中Q為G418r抗性的基因工程菌株YFGI, 為Zeor抗性的基因工程菌株YFG2 ；圖4為乙醇脅迫條件下菌株的生長曲線；(■，□)對照菌株Y12;(.，〇)基因工程菌株YFG12 ; ( ▲，Δ )基因工程重排子FGl ;圖中空心圖標(biāo)為0% (ν/ν)乙醇脅迫條件；實(shí)心圖標(biāo)為10% (ν/ν)乙醇脅迫條件；圖5為濃醪發(fā)酵性 能測試；㈩出發(fā)菌株Ζ87 ; ( □)對照菌株Υ12 ;(〇)基因工程菌株YFG12 ;(▲)基因工程重排子FG1。Α:殘?zhí)牵籅:乙醇。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本專利技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本專利技術(shù)的保護(hù)范圍并不僅限于此:實(shí)施例1:工業(yè)釀酒酵母甘油代謝工程菌株的獲得1、單倍體出發(fā)菌株的獲得將工業(yè)釀酒本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法，所述方法包括：（1）誘導(dǎo)釀酒酵母菌株產(chǎn)孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Y1和交配型α的?單倍體菌株Y2作為出發(fā)菌株；（2）然后分別敲除菌株Y1和菌株Y2的編碼甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因FPS1，并在FPS1位點(diǎn)整合表達(dá)變鏈球菌（Streptococcus?mutans）的3?磷酸甘油醛脫氫酶（GAPN），對單倍體Y1和Y2分別采用G418r和Zeor抗性標(biāo)記篩選，獲得單倍體基因工程菌株：G418r抗性菌株YFG1和Zeor抗性菌株YFG2；（3）分別使用紫外和EMS對菌株YFG1和菌株YFG2進(jìn)行誘變，獲得四個突變庫：YFG1紫外誘變庫、YFG1?EMS誘變庫、YFG2?紫外誘變庫和YFG2?EMS誘變庫；（4）以體積濃度8%的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進(jìn)行第一輪全基因組重排，用含300μg/mL?G418?和50μg/mL?Zeocin的YPD平板篩選重排子，誘導(dǎo)重排子產(chǎn)孢破壁后，用體積濃度12%?的乙醇YPD平板篩選生長迅速的單菌落進(jìn)行第二輪全基因組重排，用含300μg/mL?G418?和50μg/mL?Zeocin的YPD平板篩選重排子，通過模擬工業(yè)原料的濃醪發(fā)酵測試，獲得低副產(chǎn)物合成、高糖醇轉(zhuǎn)化率和高乙醇產(chǎn)量的工業(yè)釀酒酵母工程菌株。...

【技術(shù)特征摘要】
1.一種集成基因代謝工程和全基因組重排構(gòu)建工業(yè)釀酒酵母工程菌的方法，所述方法包括: (1)誘導(dǎo)釀酒酵母菌株產(chǎn)孢，分離純化單倍體菌株，鑒定單倍體菌株交配型，選取交配型a的單倍體菌株Yl和交配型α的單倍體菌株Υ2作為出發(fā)菌株； (2)然后分別敲除菌株Yl和菌株Υ2的編碼甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因FPSl，并在FPSl位點(diǎn)整合表達(dá)變鏈球菌(Streptococcus mutans)的3-磷酸甘油醒脫氫酶(GAPN),對單倍體I和Y2分別采用GMSlr和Zeolr抗性標(biāo)記篩選，獲得單倍體基因工程菌株:6418^抗性菌株YFGl和Zeolr抗性菌株YFG2 ； (3)分別使用紫外和EMS對菌株YFG...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳雪昌，王品美，鄭道瓊，陶香林，劉天喆，
申請(專利權(quán))人：浙江大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：浙江;33