一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法技術

本發明專利技術公開一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法。該方法利用Cre/loxp組件和G418抗性標記kanMX基因構建了HO基因敲除組件并成功轉化工業黃酒酵母，通過同源重組敲除黃酒酵母的HO基因，繼而分離獲得單倍體菌株，同時，利用半乳糖培養基誘導Cre重組酶的表達將kanMX基因切除，獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體。本發明專利技術可快速、高效地分離獲得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體，具有單倍體分離率和成活率高、工藝簡單、生產成本低的優點，為后續黃酒酵母代謝工程改造和遺傳學研究奠定了物質基礎。

【技術實現步驟摘要】

【技術保護點】
一種工業黃酒酵母單倍體的分離方法，其特征在于通過同源重組將所述工業黃酒酵母的HO基因進行了敲除；該分離方法具體操作步驟如下：?（1）HO基因敲除組件的構建：首先利用普通PCR擴增得到黃酒酵母HO基因的上、下游同源臂擴增片段以及帶有G418抗性標記的kanMX基因擴增片段，再通過降落PCR擴增得到上述三個片段的融合片段，最后利用普通PCR對所述融合片段進行特異性擴增即得黃酒酵母HO基因敲除組件；所述上游同源臂擴增片段包括上游同源臂序列及與kanMX基因5’端互補的序列(簡稱序列A)，所述下游同源臂擴增片段包括下游同源臂序列及與kanMX基因3’端互補的序列（簡稱序列B）；所述kanMX基因擴增片段包括kanMX基因序列及位于該片段兩端分別與上游同源臂序列3’端、下游同源臂序列5’端互補的序列（分別簡稱序列C和序列D）；所述kanMX基因序列與所述序列C、序列D之間均含有可被Cre重組酶識別的loxp位點；所述序列A、序列B、序列C和序列D均為20～30bp；?（2）黃酒酵母HO基因的敲除：將步驟（1）所得HO基因敲除組件轉化工業黃酒酵母菌株，通過G418抗性篩選獲得陽性轉化子并鑒定；?（3）黃酒酵母單倍體的分離：取步驟（2）中鑒定正確的陽性轉化子接種于YPD培養基進行活化；收集酵母泥并將其堆積于生孢培養基，于26～28℃培養3～5d；挑取所述生孢培養基上的菌落，經蝸牛酶酶解破壁處理得酶解菌液，振蕩打散孢子，再涂布于YPD培養基于28～30℃培養至菌落長出，挑取菌落經鑒定正確后得到含有抗性基因kanMX的單倍體菌株；?（4）抗性基因的切除：將含有Cre重組酶基因的工程質粒轉化步驟（3）所得單倍體菌株，取陽性克隆轉化子接種于半乳糖培養基連續培養5～10代，誘導Cre重組酶表達以切除抗性基因kanMX，得到抗性基因丟失菌株；將該菌株連續培養10代以上，丟失上述工程質粒，即得不含外來抗性基因的工業黃酒酵母單倍體菌株。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陸健，吳殿輝，陳堅，李曉敏，謝廣發，申超，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：