本發(fā)明專利技術(shù)利用克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合突變和菌株馴化技術(shù)來獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的酵母。用于本發(fā)明專利技術(shù)中的所述克隆和轉(zhuǎn)化可將木糖代謝基因轉(zhuǎn)化到酵母中以解決一些酵母菌株無法利用木糖產(chǎn)生乙醇的問題。用于本發(fā)明專利技術(shù)中的所述突變和菌株馴化可提高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率以解決低消耗率和產(chǎn)率的問題。通過組合上文所提及的技術(shù)手段，本發(fā)明專利技術(shù)意外地獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的突變體。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及具有高木糖消耗率的分離酵母菌株和產(chǎn)生乙醇的發(fā)酵方法。具體來說，本專利技術(shù)提供具有高木糖消耗率的酵母屬(Saccharomyces)菌株。
技術(shù)介紹
過去數(shù)十年間對傳統(tǒng)石化燃料(以石油為主的燃料)的大規(guī)模消費(fèi)已付出了很高的代價(jià)并造成大量污染。而且，人們已認(rèn)識到世界石油儲量并非無窮無盡，且隨著環(huán)境意識逐漸成長，已刺激人們開始研究替代性燃料的可行性，例如纖維乙醇，其可降低CO2產(chǎn)生。目前用于產(chǎn)生乙醇的方法包括以下操作階段:(a)使適當(dāng)原材料發(fā)酵以獲得發(fā)酵產(chǎn)物和(b)蒸餾通過發(fā)酵獲得的產(chǎn)物，藉此產(chǎn)生乙醇。目前主要使用屬于酵母屬的酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為乙醇發(fā)酵的種菌。釀酒酵母細(xì)胞為圓形到卵形，直徑為5 - 10微米且可有效利用己糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖等。上文所提及的發(fā)酵方法包括在含有氮源、碳源和微量元素等的培養(yǎng)基中接種釀酒酵母且在適當(dāng)條件下執(zhí)行發(fā)酵，且其涉及化學(xué)反應(yīng)=C6H12O6 — 2CH3CH20H+2C02。可使用各種生質(zhì)原料進(jìn)行酒精生產(chǎn)。用于通過發(fā)酵制造乙醇的多種多樣的原材料可方便地分類為三種類型的農(nóng)業(yè)原材料:糖、淀粉和木質(zhì)纖維素材料。盡管生質(zhì)乙醇可通過多種不同來源獲得的糖或淀粉發(fā)酵來產(chǎn)生，但迄今為止，用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)燃料酒精的底物是蔗糖和玉米淀粉。使用糖或淀 粉來生產(chǎn)乙醇的技術(shù)已發(fā)展成熟；然而，所述底物成本高，其可能與食品供應(yīng)競爭且從所述來源生產(chǎn)乙醇不足以滿足未來對燃料工業(yè)的需求。因此，業(yè)內(nèi)對從木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的興趣逐漸增加。由于木質(zhì)纖維素可再生，資源豐富，不與食品供應(yīng)競爭且可以相對較低的成本獲得，所以木質(zhì)纖維素是諸如玉米粒等其它乙醇原料的合意替代品。擴(kuò)大燃料乙醇生產(chǎn)要求能使用較低成本的原料。目前，只有木質(zhì)纖維素原料可從植物生物質(zhì)獲得足夠數(shù)量來代替用于生產(chǎn)乙醇的作物。木質(zhì)纖維素材料中的主要可發(fā)酵糖是葡萄糖和木糖，其分別占木質(zhì)纖維素的約40%和25%。然而，大多數(shù)能進(jìn)行酒精發(fā)酵的酵母(如釀酒酵母)不能使用木糖作為碳源。工業(yè)為了能從木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇，需要具有這些特性的生物體。科學(xué)家利用遺傳技術(shù)或菌株馴化來改良用于產(chǎn)生乙醇的酵母或細(xì)菌的木糖發(fā)酵。US5789210提供能有效使單獨(dú)的木糖發(fā)酵或同時(shí)使木糖與葡萄糖發(fā)酵的酵母菌株，其可使用重組DNA和基因克隆技術(shù)來產(chǎn)生,且所述技術(shù)已用于產(chǎn)生含有克隆木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XD)和木酮糖激酶(XK)基因的重組酵母，所述基因與不受葡萄糖的存在抑制的啟動子融合。US6582944涉及經(jīng)木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化的新穎重組酵母菌株，其能將木糖還原為木糖醇并因此能在活體內(nèi)產(chǎn)生木糖醇。伯恩(Bjorn)等人提供酵母菌株TMB3001，其通過用木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化來解決不能代謝木糖以產(chǎn)生乙醇的問題(伯恩J(Biorn J)、巴貝HH(Barbel HH).非氧化性磷酸戊糖途徑控制木糖的發(fā)酵速率但不控制 TMB3001 中的木糖(The non-oxidative pentose phosphate pathway controls thefermentation rate of xylose but not of xylose in TMB3001), 2002,歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合會酵母研究(FEMS Yeast Research) 2:227-282)。然而，其仍具有以下問題:木糖消耗率低(0.13g木糖/g生物質(zhì)/小時(shí))和乙醇產(chǎn)率低(0.15g產(chǎn)物/g所消耗木糖)。為解決這些問題，約翰松(Johansson)等人另外將轉(zhuǎn)醛醇酶基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中以獲得新菌株TMB3026，其可將木糖消耗率從0.12提高到0.23。(伯恩J，巴貝HH.非氧化性磷酸戊糖途徑控制木糖的發(fā)酵速率但不控制TMB3001中的木糖，2002，歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合會酵母研究2:227-282);然而，仍未滿足對工業(yè)生產(chǎn)的要求。凱撒(Kaisa)等人另外產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母TMB3057，其改良木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶以及缺失的醛糖還原酶基因(GR3)的基因表達(dá)，從而提高乙醇產(chǎn)率并降低木糖醇副產(chǎn)物的形成(凱撒K、羅曼F (Romain F)、巴貝HH、瑪麗GG (Marie GG).木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的高活性通過重組釀酒酵母改良木糖發(fā)酵(High activity of xylose reductase and xylitol dehydrogenase improvesxylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae), 2007,應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(Appl.Microbiol.Biotechnol.73:1039-1046))。然而，此菌株仍具有木糖消耗率低(0.25g木糖/g生物質(zhì)/小時(shí))和乙醇產(chǎn)率低(0.27g產(chǎn)物/g所消耗木糖)的問題。此外，伊麗莎白(Elizebath)等人使用基因經(jīng)修飾的酵母424A(LNH-ST)，其經(jīng)粗糙鏈孢霉(N.crassa)和近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)的木糖還原酶基因以及樹干畢赤酵母(P.stipitis)的木糖醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)化且具有三個氨基酸的優(yōu)化密碼子(伊麗莎白C、米洛斯拉夫 S.(Miroslav S.)、南希 W YH (Nancy W YH)、內(nèi)森 SM (Nathan SM),乙酸和 pH 對葡萄糖與木糖通過遺傳改造的釀酒酵母菌株共發(fā)酵為乙醇的效應(yīng)(Effect of acetic acidand pH on the cofermentation of glucose and xylose to ethanol by a geneticallyengineered strain of Saccharomyces cerevisiae), 2010,歐洲微生物學(xué)會聯(lián)合會酵母研究10:385-393)。此菌株也利用GAPDH啟動子來控制TKLl、TALl、RKLl和RPEl的磷酸戊糖途徑。然而，其仍具有以下問題:木糖消耗率低(在PH5下0.27g木糖/g生物質(zhì)/小時(shí))和乙醇產(chǎn)率低(0.785g產(chǎn)物/g所消耗木糖)和對乙酸的耐受性低(在培養(yǎng)基含有l(wèi)g/L乙酸時(shí)，木糖消耗率從0.354降低到015)。`因此，業(yè)內(nèi)非常需要生物質(zhì)(例如木糖)到乙醇的轉(zhuǎn)化率改良的菌株和以較高產(chǎn)率產(chǎn)生乙醇的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供分離酵母菌株，其木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物質(zhì)/小時(shí)且包含一種或一種以上得自DSMZ保藏號25508的釀酒酵母菌株FENC-OOO的木糖代謝基因。本專利技術(shù)另外提供產(chǎn)生乙醇的方法，其包含以下步驟:(a)在適宜發(fā)酵條件下用本專利技術(shù)的分離酵母菌株使含有木糖或葡萄糖來源的培養(yǎng)基發(fā)酵；和(b)從所述培養(yǎng)基回收乙醇。【附圖說明】圖1顯示實(shí)例2中所提及不同菌株的木糖消耗率。圖2顯示實(shí)例3中所提及釀酒酵母突變株的木糖消耗率。【具體實(shí)施方式】本專利技術(shù)利用克隆和轉(zhuǎn)化技術(shù)以及突變和菌株馴化技術(shù)來獲得具有高木糖消耗率和乙醇產(chǎn)率的酵母。用于本專利技術(shù)中的克隆和轉(zhuǎn)化可將木糖代謝基因轉(zhuǎn)化到酵母中以解決一些酵母菌株無法利用木糖產(chǎn)生乙醇的問題。用于本專利技術(shù)中的突變和本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種具有DSMZ保藏號25508的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)FENC?000的分離菌株。
【技術(shù)特征摘要】
2012.09.27 TW 1011356551.一種具有 DSMZ 保藏號 25508 的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) FENC-000 的分離菌株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離菌株，其具有選自由以下組成的群組的木糖代謝基因:木糖還原酶基因、木糖醇脫氫酶基因、木酮糖激酶基因和木糖異構(gòu)酶。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離菌株，其是通過以下方式獲得:克隆一個或一個以上木糖代謝基因，將所述基因轉(zhuǎn)化到宿主酵母菌株中，用誘變劑使所得菌株突變且選擇木糖消耗率高于1.1g木糖/克生物質(zhì)/小時(shí)的酵母菌株。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離菌株，其可產(chǎn)生乙醇和以下物質(zhì)中的至少一種:乳酸、乙酸、琥珀酸、丙烯酸、檸檬酸、3-羥基-丙酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、β -內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素。5.一種用于產(chǎn)生乙醇的方法，其包含以下步驟:(a)在適宜...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：莊育泉，蔡秀虹，
申請(專利權(quán))人：遠(yuǎn)東新世紀(jì)股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：臺灣;71
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