一種含有重組腺病毒的制劑制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種含有重組腺病毒的制劑，所述制劑由重組腺病毒、緩沖液或緩沖體系和保護(hù)劑組成，其中，所述的緩沖液或緩沖體系選自Tris-HCl緩沖液、磷酸氫二鈉–檸檬酸緩沖液、精氨酸-鹽酸的任一種；所述的保護(hù)劑選自丙二醇、聚乙二醇400或二甲基亞砜。本發(fā)明專利技術(shù)制劑具有組分簡單，不含有二價(jià)陽離子鹽和非離子表面活性劑，如MgCl2和吐溫-80等，卻能在2～8℃甚至室溫很好保存腺病毒，并使其具有良好的穩(wěn)定性等突出優(yōu)點(diǎn)。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及重組腺病毒，尤其涉及一種含有重組腺病毒的制劑。
技術(shù)介紹
根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《關(guān)于發(fā)布化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求的通知》(國食藥監(jiān)注20087號)中規(guī)定輔料選用的基本原則:在滿足需要的前提下，注射劑所用輔料的種類及用量應(yīng)盡可能少。重組腺病毒作為臨床藥物，在能維持其穩(wěn)定性的前提下，原則上要求制劑輔料種類和用量越少越好。已報(bào)道的現(xiàn)有技術(shù)中，美國專利US2006/0205080A1公開了一種包含Tris_HCl、MgCl2、甘氨酸和選自丙二醇、DMSO、PEG、蔗糖、甘油、四氫呋喃、乙二醇醚的含水共溶劑的組合物，該制劑可在2 8°C較好地保持腺病毒的活性，但該組合物中的組分較多，導(dǎo)致產(chǎn)品生產(chǎn)較為復(fù)雜，甚至加大基因治療藥物的安全性風(fēng)險(xiǎn)。此外，中國專利CN101163794A公開了一種腺病毒組合物，該組合物包含腺病毒顆粒及能維持pH在8.0-9.6的緩沖液和甘油，具有組分簡單的優(yōu)點(diǎn)，但其在2 8°C條件下長期保存腺病毒的穩(wěn)定性不理想。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一種含有重組腺病毒的制劑，該制劑由包括重組腺病毒、緩沖液或緩沖體系、阻止腺病毒發(fā)生物理或化學(xué)變化而失活的保護(hù)劑組成，所述的緩沖液或緩沖體系選自Tris-HCl緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、精氨酸-鹽酸的任一種或其組合；適合于本專利技術(shù)的保護(hù)劑選自丙二醇、聚乙二醇400或二甲基亞砜的任一種或其組合。進(jìn)一步，所述的緩沖液或緩沖體系的pH為7.4-8.6。進(jìn)一步，所述的緩沖液或緩沖體系為精氨酸-鹽酸緩沖液。進(jìn)一步，所述的緩沖液或緩沖體系為Tris-HCl緩沖液。進(jìn)一步，所述的緩沖液或緩沖體系為磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。進(jìn)一步，所述的多羥基化合物為丙二醇，進(jìn)一步，本專利技術(shù)制劑中丙二醇的濃度為5-20w/v%，優(yōu)選為 10-20w/v%。本專利技術(shù)可根據(jù)穩(wěn)定維持腺病毒活性的需要，調(diào)整和選擇所需的緩沖液濃度。本專利技術(shù)制劑中緩沖液的濃度為lO-lOOmM，所述緩沖液選自TriS-HCl緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、精氨酸-鹽酸的任一種。這樣的選擇可以取得令人滿意的保存結(jié)果。本專利技術(shù)的制劑由重組腺病毒、10_50mM緩沖液和10%丙二醇的組成，pH為7.8 ;所述的緩沖液選自Tris-HCl緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、精氨酸-鹽酸的任一種。本專利技術(shù)的磷酸氫二鈉-檸檬酸和精氨酸-鹽酸緩沖液不僅具有很好的緩沖作用，還對腺病毒具有一定程度的保護(hù)作用。本專利技術(shù)的制劑具有組分簡單，不含有二價(jià)陽離子鹽和非離子表面活性劑，如MgCl2和吐溫-80等，也能在2 8°C甚至室溫很好保存腺病毒，并使其具有良好的穩(wěn)定性等突出優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)制劑主要應(yīng)用于保存基因治療的重組腺病毒，還可應(yīng)用于保存任何野生型腺病毒或其他用途的重組腺病毒。具體地說，包括所有利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建的復(fù)制缺陷型腺病毒或增殖型腺病毒，以及所有的人或動物的野生型腺病毒或其突變腺病毒。采用國際通用的TCID50法檢定的病毒滴度值和紫外法檢定的病毒顆粒數(shù)之比值(即比活度)來評價(jià)本專利技術(shù)的重組腺病毒的穩(wěn)定性。本專利技術(shù)采用TCID50方法測定重組腺病毒滴度，其原理是:將經(jīng)過系列稀釋的病毒樣品感染293細(xì)胞，將每個稀釋度所感染一定數(shù)量的細(xì)胞孔培養(yǎng)10天，在顯微鏡下觀察各細(xì)胞孔中的細(xì)胞狀況，統(tǒng)計(jì)病變細(xì)胞孔，利用TCID50計(jì)算公式，計(jì)算病毒滴度。TCID50/ml=10-[-L-d(sKl.5)]+b其中，L:為最低稀釋度的對數(shù)；d:為稀釋對數(shù)之間的差；s:為病變陽性孔比率之和；b:為病毒接種量，換算為每暈升體積的倍數(shù)的對數(shù)。本專利技術(shù)采用分光光度法檢測腺病毒的顆粒數(shù)，其原理是:理論上，野生型5型腺病毒的成分是87%蛋白質(zhì)和13%DNA。因此，腺病毒顆粒的濃度可直接用紫外分光光度計(jì)測量。蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸殘基在277nm處有紫外吸收，而雙鏈線性DNA在260nm有最大吸收值。本法采用含有0.1%SDS (十二烷基硫酸鈉)的制劑緩沖液，將病毒衣殼分解成蛋白質(zhì)和DNA，再利用雙鏈線性DNA在260nm處具有最大吸收值，在有去垢劑時，顆粒濃度與260nm吸光值成比例，用分光光度計(jì)于260nm處測定供試品的吸光度值，采用公式(IAU=L I X 1012VP/mL)計(jì)算病毒顆粒數(shù)。測試病毒顆粒數(shù)的適用范圍為供試品病毒顆粒數(shù)≥ 2X10nVP/mL。本專利技術(shù)重組腺病毒穩(wěn)定性的最終的判斷指標(biāo)為，根據(jù)檢測所得病毒滴度和顆粒數(shù)計(jì)算所得的病毒比活度，即病毒比活度=病毒滴度/病毒顆粒數(shù)X100%。國家藥品食品監(jiān)督管理局(SFDA)在《人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》中規(guī)定，臨床重組腺病毒比活度應(yīng)高于3.3% ;張曉志等(《中華醫(yī)學(xué)雜志》，2004年，第84卷第10期)，在“重組腺病毒臨床級基因治療制品的質(zhì)量控制”中提到，評價(jià)腺病毒制劑的穩(wěn)定性時，制劑中腺病毒的比活度應(yīng)該大于3.3%。”除非另有說明，本專利技術(shù)所述百分含量均為重量體積百分含量。本專利技術(shù)的重組腺病毒的制備方法可以采用本領(lǐng)域通常的重組腺病毒制備方法所得，一般來說包括細(xì)胞復(fù)蘇、種子細(xì)胞制備、病毒感染、擴(kuò)增、細(xì)胞裂解、澄清過濾、濃縮換液、原液制備等過程本專利技術(shù)的重組腺病毒制劑的制備方法可以采用本領(lǐng)域通常制備重組腺病毒的方法，一般來說包括如下步驟:將原液進(jìn)行換液、檢測濃度、用配比好濃度的制劑輔料進(jìn)行稀釋、除菌、分裝得到成品。本專利技術(shù)的另一目的在于提供重組腺病毒制劑用于制備基因治療藥物中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的重組腺病毒制劑具有下述優(yōu)點(diǎn):本專利技術(shù)的重組腺病毒制劑不僅可以很好保存重組腺病毒的活性，有效地防止腺病毒的聚集或分裂，而且組分簡單，不含有二價(jià)陽離子鹽，如MgCl2，利于重組腺病毒的生產(chǎn)和臨床使用。因而，本專利技術(shù)的重組腺病毒制劑不僅可以良好保存重組腺病毒及其其他腺病毒，還具有易于生產(chǎn)控制和產(chǎn)業(yè)化，制造成本低，制劑安全性更高更好等優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)的制劑在重組腺病毒的保存上具有突出的優(yōu)勢。具體實(shí)施例方式以下將結(jié)合實(shí)施例具體說明本專利技術(shù)，本專利技術(shù)的實(shí)施例僅用于說明本專利技術(shù)的技術(shù)方案，并不是對本專利技術(shù)的進(jìn)一步限制。實(shí)施例1pH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響為了研究pH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響，在25°C條件下，我們研究了ρΗ6.8 8.6范圍內(nèi)，pH值分別為6.8,7.2,7.4,7.6,7.8,8.2,8.6時，pH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響。專利技術(shù)人通過檢測制劑中重組腺病毒的病毒滴度(TCID50/mL)和比活度，研究了 pH值對重組腺病毒穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見表I。表IpH值對制劑中重組腺病毒穩(wěn)定性的影響本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種含有重組腺病毒的制劑，所述制劑由重組腺病毒、緩沖液和二甲基亞砜組成，其中，所述的緩沖液選自Tris?HCl緩沖液、磷酸氫二鈉?檸檬酸緩沖液、精氨酸?鹽酸緩沖液的任一種或其組合。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種含有重組腺病毒的制劑，所述制劑由重組腺病毒、緩沖液和二甲基亞砜組成，其中，所述的緩沖液選自TriS-HCl緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、精氨酸-鹽酸緩沖液的任一種或其組合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，所述緩沖液的pH為7.4-8.6。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，所述制劑中二甲基亞砜的濃度為5-20w/V%。4.根據(jù)權(quán)利要求3...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊艷艷，付競峰，
申請(專利權(quán))人：成都康弘生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：