cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法及重組腺病毒和應用技術

本發明專利技術公開了一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法及重組腺病毒和應用，從石斑魚頭腎組織和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因和hLTF基因，將獲得的目的基因克隆到pDC315穿梭載體中，將含有目的基因的穿梭質粒與腺病毒骨架質粒經脂質體共轉染HEK293細胞，包裝獲得高滴度的重組腺病毒；評價cLYZ基因和hLTF基因在腺病毒介導下對奶牛乳房炎主要致病菌的聯合抑制作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及構建重組腺病毒的方法，具體說，是一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法及重組腺病毒和應用。
技術介紹
奶牛乳房炎又被稱為奶牛乳腺炎，是奶牛乳腺受到外界刺激或致病菌感染時所發生的一種炎癥反應。其不僅會引起奶牛產乳量的下降，縮短奶牛的更替周期，嚴重時甚至會造成患病奶牛泌乳能力的完全喪失。因此，奶牛乳房炎的臨床防治是一直困擾奶牛養殖業的一大難題。目前該病的防治主要通過提過規范化養殖管理及使用抗生素和化療藥物，但由于不同地區致病菌的差異以及抗生素等的長期不規范使用，在治療過程中產生的細菌耐藥性等問題常常給地方性奶牛乳房炎的治療帶來困難。為了應對上述問題，臨床上亟需一種新的研究策略來防治奶牛乳房炎。目前，隨著基因療法的日益興起，使用基因藥物代替常規抗生素預防和治療奶牛乳房炎，已成為應對抗生素濫用導致的細菌耐藥性增強等一系列問題的研究重點和熱點。與哺乳動物相比較，魚類的獲得性免疫系統較脆弱，固有免疫在抵抗外來病原入侵中發揮著極其重要的作用，石斑魚的c型溶菌酶(c type Lysozyme,cLYZ)就是其體內重要的非特異性免疫因子之一，不僅能抑制革蘭氏陽性菌而且對革蘭氏陰性菌也有抑制作用。人乳鐵蛋白(Human Lactoferrin,hLTF)是主要存在于乳汁中的一種鐵結合性糖蛋白，富含多種氨基酸，具有廣譜的抗菌性及免疫作用，抗氧化作用，抗炎癥，抗病毒，抗癌癥作用等生物學功能。由于hLTF具有強烈地螯合鐵離子的作用，而鐵元素是幾乎所有細菌生長不可缺少的，因此，hLTF就可以阻止細菌利用鐵離子而起到抑菌殺菌的作用；其次，hLTF作為蛋白酶，可以降解一些細菌的毒力，從而降低微生物的
致病性。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是，提供一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法及重組腺病毒和應用。將cLYZ基因的廣譜抑菌作用、hLTF基因廣泛高效抑菌的特性和腺病毒載體系統高效穩定表達外源基因的優勢結合起來，構建出可以表達上述基因的重組腺病毒，最終檢驗在腺病毒介導下cLYZ和hLTF基因對奶牛乳房炎主要致病菌的聯合抑菌作用。為進一步利用重組腺病毒在體內外抑制奶牛乳房炎致病菌的生長及研制奶牛乳房炎治療和預防疫苗奠定試驗基礎。為了解決上述技術問題，本專利技術采用的技術方案是：一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法，包括以下步驟：1)從石斑魚頭腎組織總RNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因序列GI:JQ-287658.1和hLTF基因序列GI:AY-875691.1；所述的cLYZ基因和hLTF基因的擴增包括：以cLYZ-F SEQ ID NO：1和cLYZ-R SEQ ID NO：2為引物，以石斑魚頭腎組織總RNA為模版，擴增cLYZ基因序列；以hLTF-F SEQ ID NO：3和hLTF-R SEQ ID NO：4為引物，以人乳體細胞總RNA為模版，擴增hLTF基因序列；2)將獲得的目的基因分別克隆到pDC315-MCS-EGFP穿梭載體中，與骨架載體pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉染HEK293細胞，包裝獲得重組腺病毒Ad-cLYZ、Ad-hLTF和Ad-cLYZ-hLTF。所述的構建cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的方法及制備的重組腺病毒。所述的構建cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的方法及制備的重組腺病毒在防治奶牛乳房炎中細菌性疾病生物制品方面的應用。本專利技術的有益效果是：將cLYZ的廣譜抑菌效應、hLTF的廣泛抑菌特性和腺病毒載體系統高效穩定表達外源基因的優勢結合起來，構建出包含上述基因的重組腺病毒，檢驗在腺病毒介導下cLYZ和hLTF基因對奶牛乳房炎小
鼠模型主要致病菌的聯合抑菌作用。通過檢測重組腺病毒在HEK293細胞中的表達蛋白對大腸桿菌(K88)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、停乳鏈球菌(ATCC 9809)和無乳鏈球菌等多株乳房炎致病菌的抑菌活性和最小抑菌濃度(MIC)，綜合評價了重組腺病毒對奶牛乳房炎小鼠模型主要致病菌的抑菌作用，研究結果顯示重組腺病毒在體外表達的目的蛋白可以有效抑制5種試驗菌株。本專利技術最終研制出一種針對乳房炎動物模型細菌性疾病的廣譜疫苗。附圖說明圖1是hLTF和Ec-cLYZ基因RT-PCR擴增結果(M:DL 2502bp DNA分子質量標準；1：hLTF基因RT-PCR擴增產物；2：Ec-cLYZ基因RT-PCR擴增產物)。圖2是pMD-cLYZ和pMD-hLTF質粒的雙酶切鑒定結果(M：DL 2502bp DNA Marker；1：pMD-hLTF經Nhe I和Sal I的雙酶切產物；2：pMD-cLYZ經EcoR I和Nhe I的雙酶切產物)。圖3是目的片段與腺病毒穿梭載體的亞克隆結果(M：DL 2502bp DNA Marker；1：pDC315-cLYZ的菌液PCR；2：pDC315-hLTF的菌液PCR；3：pDC315-cLYZ-hLTF的菌液PCR)。圖4是穿梭載體的雙酶切鑒定結果(M：DL 2502bp DNA Marker；1：pDC315-cLYZ經EcoR I和Nhe I的雙酶切產物；2：pDC315-hLTF經Nhe I和Sal I的雙酶切產物；3：pDC315-cLYZ-hLTF經EcoR I和Sal I的雙酶切產物)。圖5是熒光檢測重組腺病毒在HEK 293細胞中的表達結果(10×)(A：正常HEK 293細胞圖；B：重組腺病毒Ad-cLYZ感染HEK 293細胞后24h圖；C：重組腺病毒Ad-hLTF感染HEK 293細胞感染后24h熒光圖；D：重組腺病毒Ad-cLYZ-hLTF感染HEK 293細胞感染后72h圖；E：重組腺病毒Ad-GFP感染HEK 293細胞感染后24h熒光圖)。圖6是目的基因在HEK293細胞中mRNA轉錄的RT-PCR檢測(M：DL2502DNA
分子質量標準；1：Ad-cLYZ-hLTF轉染細胞轉錄cLYZ基因；2：Ad-cLYZ-hLTF轉染細胞轉錄hLTF基因；3：Ad-cLYZ-hLTF轉染細胞轉錄cLYZ-hLTF基因；4：Ad-cLYZ轉染細胞轉錄cLYZ基因；5：Ad-hLTF轉染細胞轉錄hLTF基因)。圖7是Western blotting檢測目的蛋白在HEK293細胞中的表達。圖8是BCA定量方法測定重組腺病毒感染HEK293細胞后蛋白提取物濃度所繪制的標準曲線。具體實施方式下面結合附圖和具體實施方式對本專利技術作進一步詳細說明：隨著分子生物學、免疫學、病理學及相關學科的發展，基因治療現已成為疾病防治研究的熱點。目前，腺病毒(adenovirus,Ad)載體療法是基因治療中最有前景的基因轉移方法之一，它能有效的將外源基因傳遞到各種靶細胞或組織中，載體的構建和操作簡單，宿主范圍廣，感染性強，不整合入宿主染色體，在增殖和非增殖細胞中均可感染和表達多種目的基因。魚類是脊椎動物亞門中最原始最低級的類群，雖具有特異性和非特異性免疫系統，但與哺乳動物相比，其特異性免疫系統不發達。因此，魚類非特異性免疫系統主要擔負著清除和降解入侵機體的病原微生物和有本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：1)從石斑魚頭腎組織總RNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因序列GI:JQ?287658.1和hLTF基因序列GI:AY?875691.1；所述的cLYZ基因和hLTF基因的擴增包括：以cLYZ?F?SEQ?ID?NO：1和cLYZ?R?SEQ?ID?NO：2為引物，以石斑魚頭腎組織總RNA為模版，擴增cLYZ基因序列；以hLTF?F?SEQ?ID?NO：3和hLTF?R?SEQ?ID?NO：4為引物，以人乳體細胞總RNA為模版，擴增hLTF基因序列；2)將獲得的目的基因分別克隆到pDC315?MCS?EGFP穿梭載體中，與骨架載體pBHGlox(delta)E1,3Cre共轉染HEK293細胞，包裝獲得重組腺病毒Ad?cLYZ?hLTF。

【技術特征摘要】
1.一種cLYZ和hLTF雙抑菌基因重組腺病毒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：1)從石斑魚頭腎組織總RNA和人乳體細胞總RNA中分別擴增出cLYZ基因序列GI:JQ-287658.1和hLTF基因序列GI:AY-875691.1；所述的cLYZ基因和hLTF基因的擴增包括：以cLYZ-F SEQ ID NO：1和cLYZ-R SEQ ID NO：2為引物，以石斑魚頭腎組織總RNA為模版，擴增cLYZ基因序列；以hLTF-F SEQ ID NO：3和hLTF-R SEQ I...

【專利技術屬性】
技術研發人員：金天明，弓建芳，張東超，李小慧，高珂珂，林靜，孟佳麗，尚翠玲，李昕，
申請(專利權)人：天津農學院，
類型：發明
國別省市：天津;12