一種重組腺相關(guān)病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)的重組腺相關(guān)病毒，所述重組腺相關(guān)病毒是通過將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，形成的重組腺相關(guān)病毒。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了該重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建方法以及其應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)的重組腺相關(guān)病毒，利用攜帶有腫瘤相關(guān)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒感染DC細(xì)胞，在DC細(xì)胞中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原蛋白，該重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法中還聯(lián)合PD-1基因沉默CTL細(xì)胞。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組腺相關(guān)病毒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
免疫細(xì)胞腫瘤治療技術(shù)是一種以現(xiàn)代生物技術(shù)手段激發(fā)自身免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤的新型的、具有顯著療效的治療方法，是繼手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)治療法之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。目前大量研究已經(jīng)表明，對于中晚期惡性腫瘤患者而言，過繼性細(xì)胞免疫治療具有其他治療方式無法比擬的優(yōu)越性，是治療中晚期惡性腫瘤的有效手段之一，具有十分廣闊的臨床應(yīng)用前景。雖然國內(nèi)已經(jīng)有很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行了腫瘤免疫治療的相關(guān)研究和臨床實踐，但仍存在很多問題，主要表現(xiàn)在：(1)以缺乏特異性的CIK治療為主，技術(shù)水平比較落后；(2)未全面掌握國際先進(jìn)的核心技術(shù)，醫(yī)院細(xì)胞制備質(zhì)量管理不符合要求，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和流程；(3)缺乏大規(guī)模的臨床數(shù)據(jù)支持，無法確認(rèn)有效性標(biāo)準(zhǔn)等。這些問題制約了國內(nèi)腫瘤免疫治療技術(shù)的發(fā)展，也給患者的治療帶來隱患。腺相關(guān)病毒(簡稱AVV)屬微小病毒家族的成員，為無包膜的單鏈線狀DNA病毒。AAV的基因組約4700bp，包括上下游兩個開放讀碼框架(ORF)，位于分別由145個核苷酸組成的2個反向末端重復(fù)序列(ITR)之間。腺相關(guān)病毒具有安全性高、免疫原性低、能介導(dǎo)基因在動物體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是最有潛力成為基因治療工具的載體。但是目前并沒有靶向性強(qiáng)的、適于腫瘤治療的重組腺相關(guān)病毒。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)所要解決的第一個技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中的腫瘤免疫治療特異性較差、治療效果不理想的問題，進(jìn)而提供一種可實現(xiàn)靶向性強(qiáng)的免疫治療的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法。本專利技術(shù)要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種感染DC細(xì)胞后免疫原性更低、抗原致敏時間更長、DC抗原效率更高的攜帶有腫瘤抗原基因的重組腺相關(guān)病毒。本專利技術(shù)的重組腺相關(guān)病毒，所述重組腺相關(guān)病毒是通過將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，形成的重組腺相關(guān)病毒。構(gòu)建本專利技術(shù)所述的重組腺相關(guān)病毒的方法，包括以下步驟：(1)將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，使所述腫瘤抗原基因進(jìn)入包含ITR的載體，形成重組質(zhì)粒；(2)大量抽提步驟1)中所述的重組質(zhì)粒，與pHelper和pAAV-RC質(zhì)粒采用磷酸鈣沉淀法共同轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，培養(yǎng)2--3天，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，采用反復(fù)凍融法收集粗病毒液。或者，構(gòu)建本專利技術(shù)所述的重組腺相關(guān)病毒的方法，包括以下步驟：(1)將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，使所述腫瘤抗原基因進(jìn)入包含ITR的載體，形成重組質(zhì)粒；(2)從生產(chǎn)病毒的細(xì)胞中純化AAV2病毒顆粒，細(xì)胞經(jīng)AAVproExtractionSolution初步純化后，利用核酸酶進(jìn)行處理，然后讓AAV2顆粒與預(yù)裝柱結(jié)合，經(jīng)過洗滌和洗脫，即可得到高純度的AAV顆粒。需要說明的是，腫瘤相關(guān)抗原(TAA)不僅作為腫瘤標(biāo)志物與腫瘤特異性的抗體結(jié)合用于免疫檢測與診斷，而且也是抗腫瘤免疫攻擊的靶點(diǎn)。腫瘤抗原基因的克隆與鑒定，為腫瘤疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。腫瘤抗原目的基因一般基因是指編碼某抗原的cDNA序列，要求該基因片段能在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。利用抗原遞呈細(xì)胞(APC，如樹突狀細(xì)胞)遞呈抗原并激活T細(xì)胞的能力。從外周血分離、擴(kuò)增樹突狀細(xì)胞，再導(dǎo)入腫瘤相關(guān)抗原基因，基因表達(dá)后遞呈抗原信息以激活T細(xì)胞，產(chǎn)生抗腫瘤特異性免疫反應(yīng)。目的基因一般是抗原基因的全長cDNA序列，用以表達(dá)該抗原的全蛋白。但有些抗原基因表達(dá)的全蛋白存在毒副作用，可能誘發(fā)自身免疫反應(yīng)，或者是全蛋白抗原遞呈效果不如抗原決定簇或某一段基因表達(dá)的蛋白有效。需要針對該基因通過基因工程方法進(jìn)行改良或選擇其中的一段基因進(jìn)行表達(dá)。根據(jù)不同的目的基因的特性，針對性地確定需要表達(dá)的基因序列。本專利技術(shù)所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，包括以下步驟(1)：使所述重組腺相關(guān)病毒感染DC細(xì)胞，并在DC細(xì)胞中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原蛋白。優(yōu)選地，所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法還包括以下步驟(2)：采用siRNA干擾方式沉默PD-1基因，阻斷PD-1/PD-L1信號。所述PD-1/PD-L1的含義為PD-1或者PD-L1，其英文名稱為ProgrammedDeath1。優(yōu)選地，所述步驟(2)具體為：a)將具有SEQIDNo.1所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-1、具有SEQIDNo.2所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-2、具有SEQIDNo.3所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-3，上述三對針對PD-1mRNA的siRNA作用靶點(diǎn)，合成發(fā)夾樣的兩端配對siRNA的模板DNA，中間以6個脫氧核苷酸的LOOP相連，分別在3’端加入終止信號polyT，兩端分別加入限制性內(nèi)切酶AgeI和EcoRI的酶切位點(diǎn)粘性末端，同時合成互補(bǔ)DNA鏈；b)將具有SEQIDNo.4所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-1-1、具有SEQIDNo.5所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-1-2、具有SEQIDNo.6所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-2-1、具有SEQIDNo.7所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-2-2、具有SEQIDNo.8所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-3-1、具有SEQIDNo.9所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-3-2插入載體；c)合成ShRNA的模板DNA雙鏈，構(gòu)建shRNA重組質(zhì)粒。其中，所述SEQIDNo.1所示的序列結(jié)構(gòu)如下：CGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTA；所述SEQIDNo.2所示的序列結(jié)構(gòu)如下：TGAGCAGACGGAGTATGCCACCATT；所述SEQIDNo.3所示的序列結(jié)構(gòu)如下：CAGACGGAGTATGCCACCATTGTCT；所述SEQIDNo.4所示的序列結(jié)構(gòu)，即siRNA-1-1，如下：CcggCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACTCGAGTACCAGTTTAGCACGAAGCTCTCCGTTTTTg；所述SEQIDNo.5所示的序列結(jié)構(gòu)，即siRNA-1-2，如下：aattcaaaaaCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACTCGAGTACCAGTTTAGCACGAAGCTCTCCG；所述SEQIDNo.6所示的序列結(jié)構(gòu)，即siRNA-2-1，如下：CcggTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTCTCGAGAATGGTGGCATACTCCGTCTGCTCATTTTTg；所述SEQIDNo.7所示的序列結(jié)構(gòu)，即siRNA-2-2，如下：aattcaaaaaTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTCTCGAGAATGGTGGCATACTCCGTCTGCTCA；本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，所述重組腺相關(guān)病毒是通過將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV?MCS中，形成的重組腺相關(guān)病毒。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，所述重組腺相關(guān)病毒是通過將腫瘤抗原基因插
入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，形成的重組腺相關(guān)病毒。
2.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，使所述腫瘤抗原基因進(jìn)入包含
ITR的載體，形成重組質(zhì)粒；
(2)大量抽提步驟1)中所述的重組質(zhì)粒，與pHelper和pAAV-RC質(zhì)粒采用磷酸鈣沉淀法
共同轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，培養(yǎng)2--3天，收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，采用反復(fù)凍融法收集粗病毒液。
3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)將腫瘤抗原基因插入到穿梭表達(dá)載體pAAV-MCS中，使所述腫瘤抗原基因進(jìn)入包含
ITR的載體，形成重組質(zhì)粒；
(2)從生產(chǎn)病毒的細(xì)胞中純化AAV2病毒顆粒，細(xì)胞經(jīng)AAVproExtractionSolution初
步純化后，利用核酸酶進(jìn)行處理，然后讓AAV2顆粒與預(yù)裝柱結(jié)合，經(jīng)過洗滌和洗脫，即可得
到高純度的AAV顆粒。
4.一種權(quán)利要求1中所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)：使所述重組腺相關(guān)病毒感染DC細(xì)胞，并在DC細(xì)胞中表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，還包括以下步驟
(2)：采用siRNA干擾方式沉默PD-1基因，阻斷PD-1/PD-L1信號。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用方法，其特征在于，所述步驟(2)具體
為：
a)將具有SEQIDNo.1所示的序列結(jié)構(gòu)的siRNA-1、具有SEQI...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：孫振華，曹暉，
申請(專利權(quán))人：厚樸生物科技蘇州有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：江蘇;32