利用分子標記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法技術

本發明專利技術公開了利用分子標記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法，屬于動物基因工程技術領域。方法包括：（1）設計鵝THRSPα基因片段的特異性引物；（2）PCR擴增反應；（3）PCR擴增產物的多態性分析；（4)優勝肉鵝親本個體的選擇等步驟工藝。本發明專利技術是依據基因型進行鵝肌肉脂肪酸性狀的選擇，具精確度高、操作簡單、選擇成本低（約0.3元/只）等特點，可在肉鵝生命早期開始選擇屠體性狀，縮短世代間隔，加速肉鵝育種進程，每代可縮短選擇時間3個月左右。該方法可在鵝品質育種領域中推廣應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及動物基因工程
，具體涉及鵝肌肉脂肪酸性狀相關基因的克隆及其在標記輔助選擇中的應用。
技術介紹
脂肪酸是構成脂肪的重要化學物質和組織細胞的重要組成部分，肌肉脂肪中的脂肪酸組成不僅影響肉品的風味，而且與消費者健康有關。營養學研究認為，人體血脂和血膽固醇含量受飲食中脂肪酸構成的影響，其中的飽和脂肪酸引起血脂升高，而不飽和脂肪酸有降血膽固醇的作用。流傳病學研究發現，飲食中的脂肪含量、脂肪酸組成與心血管疾病直接相關(Williams, 2000)。因此作為評價肌肉營養價值的重要指標之一，脂肪酸的組成已日益受到人們的重視。據報道，品種是決定肉質中脂肪酸成分變化的主要影響因素，通過培育具有優質肉用性能的畜禽品種來提高肉產品中不飽和脂肪酸含量顯得尤為重要。綜合評定不同品種動物肌肉中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸組成的差異是育種選擇素材群的前提。但由于肌肉脂肪酸在活體動物上很難 直接測定，常規育種方法是通過宰殺，取新鮮胸肌肉樣，采用氣相色譜法進行脂肪酸相對含量分析，而這種采用表現型間接對基因型進行選擇的方法存在周期長、效率低、成本高等缺點，因此常規育種方法進展較慢。為此，許多研究者正在不斷探索新的更為有效的動物肌肉脂肪酸性狀選擇技術，以改變常規選擇方法的不足。分子遺傳標記以物種基因突變造成DNA片段長度多態性為基礎，具有許多優點:(I)可以直接探測DNA水平的差異，不受時空的限制；(2)標記數量豐富、多態性高；(3)共顯性標識，可以區分純合子與雜合子；(4)可以解釋家系內某些個體的遺傳變異；(5)可以鑒定不同性別、不同年齡的個體；(6)在選擇肌肉脂肪酸性狀的過程中，不必做昂貴的屠宰試驗。由此可見，利用易于鑒定的遺傳標記，在育種計劃中納入分子標記信息進行輔助選擇是提高選擇效率，縮短世代間隔，提高選擇強度，加快遺傳進展的有效手段。近年來基因組研究的迅速發展，基因聚合、基因轉移等技術手段的應用使得分子標記輔助選擇應用于遺傳改良已成為現實，并已取得了長足進展(游小燕等，2007 ;Liu等，2008 ;Wu等，2006 ；Thue, 2002)。然而，目前國際上對于鵝肌肉脂肪酸性狀的標記輔助選擇還鮮有報道，也不曾提出鵝肌肉脂肪酸性狀的有效評定選擇方法，在鵝肌肉脂肪酸性狀的分子標記選擇領域尚屬空白。因此建立一種評定鵝肌肉脂肪酸性狀的有效分子標記方法非常必要，同時也可為具有優良肌肉脂肪酸性狀的肉鵝品種選擇提供可靠的依據。
技術實現思路
本專利技術目的是，針對有關利用分子標記技術選擇鵝肌肉脂肪酸性狀尚屬空白的不足，提供一種在鵝的生命早期就可開始、準確性高、選育周期短、成本低的利用THRSP a基因分子遺傳標記技術選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法。本專利技術所述的，是在完成下列基礎工作后取得的: 1)鵝肌肉脂肪酸性狀THRSPa基因的克隆與多態性分析: 根據 GenBank N0.EU710582.1 鵝 THRSPa 基因序列，利用 Primer 和 Oligo 軟件設計引物，上游引物序列ASF: 5 ; -GTGCTGCCTGTACCGTCCAA-3 '，下游引物序列ASR:5' -GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG-3'，以鵝血液基因組DNA為模板，進行PCR擴增反應，采用的PCR反應體系和反應條件同于
技術實現思路
中的技術方案；PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如附圖說明圖1所示，擴增產物特異性良好，片段大小與預期的221bp相符。分離純化目的片段進行直接測序，結果發現在PCR擴增產物序列中包含鵝THRSPa基因的3’側翼區部分片段，對單核苷酸多態性(SNPs)的分析結果表明，在109bp處發生一個堿基突變(C/T)(見圖2)，具有CC、CT和TT三種基因型； 2)對鵝肌肉脂肪酸相對含量的測定: 采取鵝新鮮腿肌于-70°C冷凍保存，采用氣質聯用法測定飽和脂肪酸(包括月桂酸、豆蘧酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸和山崳酸)與不飽和脂肪酸(包括十五碳烯酸、棕櫚油酸、十七碳烯酸、油酸、二十碳烯酸、芥酸、亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸)相對含量; 3)鵝THRSP°基因多態性與肌肉脂肪酸相對含量關聯性的分析: 采用SAS9.1軟件的GLM程序對THRSPa基因多態性與肌肉脂肪酸相對含量進行關聯分析，不同基因型對應的各項指標以最小二乘均數土標準誤(LSM±SE)表示，線性模型為:7" 二 P+Gi+Lj +(GL)ij +Sk+Eijk 其中:r"為性狀的觀察值，^為群體均值，Gi為基因型效應，Lj為品種效應，(GL)u為基因型與品種的互作效應，Sk為性別效應，瓦為隨機殘差。結果如表I所示，鵝THRSP a基因突變位點的3種基因型對肌肉脂肪酸相對含量存在不同程度的影響。其中CT基因型個體的飽和脂肪酸含量最高，與CC和TT基因型個體比較差異顯著0°〈0.01或7X0.05);而CC基因型個體的不飽和脂肪酸含量最高，與CT和TT基因型個體比較差異顯著0°〈0.01或/X0.05)； TT基因型個體飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸相對含量介于CT和CC基因型個體之間。 表I不同基因型浙東白鵝個體肌肉脂肪酸相對含量權利要求1.，其特征在于按以下步驟進行: (1)設計鵝THRSPa基因片段的特異性引物:根據GenBankN0.EU710582.1鵝THRSPa基因序列設計引物: 其上游引物序列為 ASF: 5' -GTGCTGCCTGTACCGTCCAA-3'； 其下游引物序列為 ASR: 5' -GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG-3'； (2)PCR擴增反應:在待選肉鵝群體中隨機選擇100-200只肉鵝個體，從各個體翅靜脈采集血液，按常規酚-氯仿方法提取血液基因組DNA，并采用上述引物和基因組DNA模板進行PCR擴增反應；采用的反應體系為25 u L =IOXPCR Buffer (Mg2+ plus) 2.5 u L,.2.5 mmol.171 dNTPl.0-3.0 u L, 10 u mol*L_1 ± 游引物 0.4-0.6 y L，10 y mol.L—1 下游引物 0.4-0.6 ii L，50 ng.U I/1 模板 DNA 0.5 u L, 5.0U.u L-1 rTaq 酶 0.15-0.35 u L,ddH2017.45-20.05 u L ；PCR 擴增反應條件為 95°C 預變性 5 min, 95°C 變性 30s, 50_60°C 退火30s，72oC延伸30s, 33-38次循環，72°C延伸10 min，4°C結束反應; (3)PCR擴增產物的多態性分析:取各個體PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離純化約221bp的目的片段進行直接測序，分析其S NPs單核苷酸多態性，明確各個體所屬的基因型； (4)優勝肉鵝親本個體的選擇:選留CC基因型的個體作為肉鵝選擇親本，淘汰CT和TT基因型的個體。全文摘要本專利技術公開了，屬于動物基因工程
方法包括(1)設計鵝THRSPα基因片段的特異性引物；(2)PCR擴增反應；(3)PCR擴增產物的多態性分析；(4)優勝肉鵝親本個體的選擇等步驟工藝。本專利技術是依據基因型進行鵝肌肉脂肪酸性狀的選擇，具本文檔來自技高網...

【技術保護點】
利用分子標記輔助選擇鵝肌肉脂肪酸性狀的方法，其特征在于按以下步驟進行：（1）設計鵝THRSPα基因片段的特異性引物：根據GenBank?No.?EU710582.1鵝THRSPα基因序列設計引物：?其上游引物序列為ASF:?5′?GTGCTGCCTGTACCGTCCAA?3′；其下游引物序列為ASR:?5′?GGGAAGCAGTTACACCATCAGAG?3′；（2）PCR擴增反應：在待選肉鵝群體中隨機選擇100?200只肉鵝個體，從各個體翅靜脈采集血液，按常規酚?氯仿方法提取血液基因組DNA，并采用上述引物和基因組DNA模板進行PCR擴增反應；采用的反應體系為25?μL：10×PCR?Buffer?(Mg2+?plus)?2.5μL，2.5?mmol?L?1?dNTP1.0?3.0μL，10μmol?L?1上游引物0.4?0.6μL，10μmol?L?1下游引物0.4?0.6μL，50?ng?μL?1模板DNA?0.5?μL，5.0U?μL?1?rTaq?酶0.15?0.35μL，ddH2O17.45?20.05μL；PCR擴增反應條件為95oC預變性?5?min，95oC變性?30s，50?60oC退火?30s，72oC延伸?30s，33?38?次循環，72oC延伸?10?min，4oC結束反應；（3）PCR擴增產物的多態性分析：取各個體PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分離純化約221bp的目的片段進行直接測序，分析其SNPs單核苷酸多態性，明確各個體所屬的基因型；（4）優勝肉鵝親本個體的選擇：選留CC基因型的個體作為肉鵝選擇親本，淘汰CT和TT基因型的個體。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李國勤，盧立志，田勇，沈軍達，陶爭榮，李進軍，王德前，陳黎，徐堅，
申請(專利權)人：浙江省農業科學院，
類型：發明
國別省市：