本發明專利技術公開了一種設計堿基替換或插入缺失的SNP分子標記的方法，該方法針對由于平常所用的TaqDNA聚合酶要進行正常擴增，其5′可以不需要與模板完全匹配，而其3′要求完全配對。針對這個特性，可以特異地將所發現的SNP位點設計在引物3′位置；針對突變型的基因設計的引物與野生型的基因會形成3′端錯配，導致不能正常擴增；同樣以野生基因設計的引物與突變型基因的3′端產生錯配，也同樣在突變型個體基因組中不能正常擴增。本發明專利技術通過兩次PCR，再通過特定技術檢測PCR結果，可以方便地確定該個體SNP位點的基因型。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于SNP檢測
，尤其涉及一種設計堿基替換或插入缺失的SNP分子標記的方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(SNP)標記技術,屬于新一代的標記技術。常用來表不不同生物個體在同一等位基因處個別堿基的差異，常常出現的單核苷酸多態性有堿基替換、堿基的插入缺失。目前，SNP是所發現的生物中存在最廣泛的變異類型，即使在不同生物個體中序列差異不大的基因中也存在一定數量的SNP位點，因此是植物遺傳研究中理想的分子標記。作為新興的分子標記，SNP有如下優點:數量多分布廣，SNP比微衛星標記密度更高，是等位基因間序列差異最為普遍的類型；SNP具有二態性特點，其不再以DNA序列長度的不同來檢測多態性，能夠用不同的方法進行基因的檢測；在啟動子區的SNP可能對基因的表達造成影響，而在編碼序列的SNP可能會影響到所編碼蛋白的結構和功能，是目前遺傳研究的熱點。目前，檢測SNP的方法很多，常用的有如下幾種:利用生物信息學的方法在已有的DNA數據庫中搜索SNP，這種方法比較直接、快捷；單鏈構象多態性(SSCP)，通過個別堿基的變化影響DNA的構象的原理來檢測SNP，操作簡單、經濟、適用面廣。但影響因素較多，如電泳溫度、凝膠濃度均可影響其靈敏性，所以穩定性不高；酶切法，基因中個別堿基的變化，可造成原來基因中部分酶切位置的變化，通過特異酶切割所擴增的序列，產生大小不一的切割片段，再利用簡單的檢測手段來可達到區分該位點的目的。酶切檢測法方便、準確，但只能分析酶切位點處的SNP，而不能檢測酶切位點以外的SNP，所以有一定局限性；雜交法，如DNA芯片技術，可以大大提高檢測速度，但價格較昂貴；測序法，對不同個體等位基因片段進行測序分析，檢測序列中的堿基變異。該法直觀、準確，但工作量大，價格昂貴；PCR法，利用引物序列3'端的SNP不能與模板有效結合，導致PCR擴增結果的不一，通過特定的手段檢測PCR結果來達到確定SNP位點的目的。PCR法方便快捷但受較多其它因子的干擾，重復性較差。利用SNP標記，人們已成功標記了一些抗病、抗逆和優質基因(Buren etal.2000 ；Brooks et al.2006 ；Mondini et al.2012)。從以上方法可以看出，目前常用的方法存在穩定性不高、有一定局限性、價格較昂貴、重復性差等。
技術實現思路
本專利技術實施例的目的在于提供一種設計堿基替換或插入缺失的SNP分子標記的方法，在獲得基因序列后，針對該基因的變異開發相應的功能標記，對研究基因的功能并有效利用該基因提供堅實的基礎。 本專利技術實施例是這樣實現的，一種設計堿基替換或插入缺失的SNP分子標記的方法，該方法將所發現的SNP位點設計在引物3'位置；該方法通過兩次PCR，再通過技術檢測PCR結果，確定出個體SNP位點的基因型。進一步，該方法引物設計方法為:兩個個體相同的基因處有一個T堿基和C堿基的替換，由Allelel特異位點T設計特異引物P1，同樣由Allele2特異位點C設計特異引物P2 ;兩對引物在Genotypel中擴增時，Pl引物能夠正常擴增出PCR產物，P2引物不能正常擴增而沒有PCR產物，確定該基因的基因型為TT ;用相同的方法擴增可以確定Gen0type2基因型為CC ;若兩者都能得到擴增產物，可確定Genotype3基因型為TC，從而分析出SNP位點。本專利技術提供的方法針對由于平常所用的TaqDNA聚合酶要進行正常擴增，其5'可以不需要與模板完全匹配，而其3'要求完全配對。針對這個特性，可以特異地將所發現的SNP位點設計在引物3'位置；針對突變型的基因設計的引物與野生型的基因會形成3'端錯配，導致不能正常擴增；同樣以野生基因設計的引物與突變型基因的3'端產生錯配，也同樣在突變型個體基因組中不能正常擴增。本專利技術通過兩次PCR，再通過特定技術檢測PCR結果，可以方便地知道該個體SNP位點的基因型。附圖說明圖1是本專利技術實施例提供的等位基因特異PCR技術原理圖2是本專利技術實施例提供的AS-PCR引物設計；黑體表示加入的錯配堿基；圖3是本專利技術實施例提供的AS-PCR引物組合篩選圖4是本專利技術實施例提供的部分F2后代基因分型結果；泳道1-20為F2代第300-319個單株的基因型結果；`圖5是本專利技術實施例提供的AS-PCR引物在24個品種中的擴增；M:DNA Ladder ；1中國春；2蘭考大粒；3長武0318 ；4鄭麥366 ；5煙農192 ；6西農979 ；7皖麥38 ；8濟麥22 ；9鄭麥9623 ；10皖麥50 ；11小偃22 ；12周麥18 ；13四川大粒；14陜麥229 ；15淮麥20 ；16西農 2611 ;17 西農 9871 ;18 蘭考 185 ;19 鄭麥 0856 ；20 明賢 169 ；21BYL3 ;22 大地 98 ;23 宿7075 ;24 徐麥 9074 ；圖6是本專利技術實施例提供的5個品種的籽粒圖。具體實施例方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。如圖1表示的是該技術引物設計原理，兩個個體相同的基因處有一個T堿基和C堿基的替換。這樣可以由Al I e I e I特異位點T設計特異引物PI，同樣由Al I e I e2特異位點C設計特異引物P2(圖1A)。兩對引物在Genotypel中擴增時，Pl引物能夠正常擴增出PCR產物，P2引物不能正常擴增而沒有PCR產物(圖1B)，可以確定該基因的基因型為TT;用相同的方法擴增可以確定Genotype2基因型為CC ;若兩者都能得到擴增產物,可確定Genotype3基因型為TC。這樣可通過簡單的電泳技術來分析該SNP位點(圖1C)。本專利技術用克隆的小麥粒重基因TaGW2的大小粒品種堿基差異為例，該基因全長cDNA1275bp,大粒品種蘭考大粒在977bp處和小粒品種中國春相比有一個“T”堿基的插入，其余部分堿基基本相同，如圖2所示，在突變位點處，根據蘭考大粒的序列設計了三個引物:F4、F6和R4。其中F4、F6為上游引物分別在其3'端第2位和第3位加入錯配堿基G ；R4為下游引物在其3'端第2位加入了錯配堿基G。由中國春的序列設計一個引物F5，在其3 ^端第2位引入錯配堿基G。此外，還分別在突變位點兩側200bp處設計一對內參引物F3和R3，擴增片段長度約540bp。通過特異引物F4、F5、F6和R4分別與內參引物F3和R3組合，便形成了 4 套引物組合(TaGW2-AS-Pl、TaGW2_AS_P2、TaGW2_AS_P3 和 TaGW2_AS_P4)，用于擴增蘭考大粒和中國春的特異序列。以蘭考大粒特異引物組合(TaGW2-AS-Pl、TaGW2-AS-P3和TaGW2-AS-P4)結合中國春特異引物組合(TaGW2_AS_P2)可鑒定基因型。引物序列列于表I中，由大連寶生物生物工程有限公司合成。表I AS-PCR引物設計；黑體表示加入的錯配堿基權利要求1.一種設計堿基替換或插入缺失的SNP分子標記的方法，其特征在于，該方法以已知功能基因SNP突變位點為參照，將此位點設計在特異引物的3'位置；通過分別設計Allelel和Al本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種設計堿基替換或插入缺失的SNP分子標記的方法，其特征在于，該方法以已知功能基因SNP突變位點為參照，將此位點設計在特異引物的3′位置；通過分別設計Allele1和Allele2特異位點兩對引物，通過兩次PCR，再通過技術檢測PCR結果，確定出個體SNP位點的基因型，通過標記功能驗證及穩定性檢測，將該分子標記用于輔助選擇育種。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：李學軍，楊子博，李立群，吳青霞，楊林，邵慧，冉從福，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：
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