本發明專利技術涉及聚乙二醇生物降解技術領域，具體地說是一種聚乙二醇水解菌株及水解能力的驗證方法。聚乙二醇水解菌為革蘭氏染色反應陰性菌PEGHB-04，經鑒定為無色桿菌屬（Achromobactersp.）。主要生物學特性為G-，桿狀，無芽孢，大小0.8~1.3×0.5~0.6μm；對明膠水解、淀粉水解、接觸酶呈陽性；對硝酸鹽還原、M.R試驗、V.P試驗、吲哚試驗呈陰性。利用液相色譜串聯質譜聯用分析（LC-MS）驗證菌株對聚乙二醇的水解能力。本發明專利技術提供了一種高效聚乙二醇水解菌，為聚乙二醇降解混合菌劑的制備提供了有效的菌株資源，并提出了聚乙二醇水解菌的高效可靠的鑒定方法。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及環境微生物
，具體地說是一種聚乙二醇水解無色桿菌PEGHB-04及其應用。
技術介紹
聚乙二醇(PEG)又稱聚乙二醇醚，化學結構式為H (CH2CH2OCH2CH2)nOH,它包括一系列由低到中等分子量的產品，其相對分子質量范圍從200到20000。通常工業生產中是以環氧已烷與乙二醇或者水慢慢加成而獲得，因為蒸汽壓大小的原因，我們通常得到的聚乙二醇產品均為不同聚合度的聚乙二醇的混合物。聚乙二醇具備潤滑、水溶、穩定、低毒、難揮發、易互溶等優越的性能，而且該聚合物的分子量有可變性，從而它被廣泛應用于醫藥品、化妝品、潤滑劑、防凍劑的生產，并大量用作非離子型表面活性劑和多晶硅切 割液。全球范圍內每年生產數百萬噸的聚乙二醇，并且絕大部分最終進入水體環境中，造成嚴重的環境污染。一般來說，聚乙二醇相對分子量越大，生物降解越難，分子量越小，則較容易進行生物降解。目前，國內外研究報道主要為單株或者多株菌株協同降解聚乙二醇，但這些報道的菌株對大分子量聚乙二醇降解速率較慢。因此，聚乙二醇水解菌對提高聚乙二醇生化降解速率具有十分重要的意義，但目前仍未見聚乙二醇水解菌株及水解能力驗證方法的報道。
技術實現思路
本專利技術的目的在于針對大分子量聚乙二醇降解速率較慢，提供了一種聚乙二醇水解無色桿菌PEGHB-04及其應用。本專利技術提供了一種聚乙二醇水解菌株，其菌株PEGHB-04是一株革蘭氏陰性菌,于2013年I月15日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號CGMCC N0.7142，經鑒定為無色桿菌屬sp.)。主要生物學特性為在LB固體培養基上，培養基配方為:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，瓊脂20.00g，去離子水1000ml，pH 7.0，30°C恒溫培養3天后，其菌落為圓形，邊緣光滑；經結晶紫染色后，在顯微鏡下觀察菌為桿狀，無芽孢，大小0.8^1.3X0.5、.6μπι;對明膠水解、淀粉水解、接觸酶呈陽性；對硝酸鹽還原、Μ.R試驗、V.P試驗、吲哚試驗呈陰性。本專利技術提供了聚乙二醇水解菌株PEGHB-04在聚乙二醇水解中的應用。本專利技術還提供了一種菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法，包括如下步驟: 1)將純化得到的菌株挑至誘導培養基中，于30°C、160r/min振蕩培養至菌體生長對數后期，即 0D600 ^ 2.5 ； 2)將步驟I)得到的培養液在離心力6000g下離心3min,棄上清液,加入等體積的IOOmmoI/L, pH7.0的磷酸緩沖液PBS搖勻后，在離心力6 OOOg下離心3min，以此方法沖洗2次，然后用IOOml無機鹽液體培養基重懸； 3)在步驟2)的IOOml重懸液中加入0.5g PEG1000,即聚乙二醇1000，并于30°C、160r/min下振蕩18 h。所述步驟I)中的誘導培養基的組成為:PEG1000 5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，酵母膏 4.0g，去離子水 1000ml，pH 7.0。所述步驟2)中的無機鹽液體培養基為:每升去離子水中含1.50 g Κ2ΗΡ04、0.50 gKH2PO4^0.20 g MgS04X7H20、l.00 g NaClU.00 g (NH4)2SO4, pH 7.0。本專利技術所有具有的優點: 1)本專利技術提供的一種聚乙二醇水解菌，大大提高聚乙二醇生物降解效率，在實踐中具有很好的應用前景； 2)本專利技術采用的LC-MS驗證聚乙二醇水解能力，技術先進，高效精準，穩定可靠，具有很好可行性和推廣性； 3)本專利技術確定了聚乙二醇LC-MS分析的基本條件，為其他聚合物的相關分析提供了一定的理論指導。附圖說明圖1聚乙二醇水解菌PEGHB-04菌落照片。圖2聚乙二醇水解菌PEGHB-04菌體結晶紫染色照片(1000X)。圖3 PEG1000水解前后的LC-MS圖譜； 其中:A.PEG1000水解前；B.PEG1000被菌株水解后。具體實施例方式以下實施例用于說明本專利技術，但不用來限制本專利技術的范圍。在不背離本專利技術精神和實質的情況下，對本專利技術方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本專利技術的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1聚乙二醇水解菌PEGHB-04的篩選與分離 取被聚乙二醇長期污染的土壤5.0g,加入至含PEG1000濃度為1000mg/L的IOOml無機鹽培養基中，無機鹽培養基配方為:每升去離子水中含1.50 g Κ2ΗΡ04、0.50 g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4X 7H20U.00 g NaClU.00 g (NH4)2SO4, pH 7.0，于 160r/min，30°C條件下振蕩培養，每隔3天按5%的接種量轉接到新鮮的無機鹽培養基中，連續轉接4次。取上面得到的富集菌液1.0ml，加入9.0ml無菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0ml配好的KT1的富集液加入9.0ml無菌水中，充分混勻配成10_2的富集液，以此類推，對富集液進行梯度稀釋。以此類推，對富集液進行梯度稀釋。吸取各梯度的稀釋液0.1ml涂布于PEG1000的濃度為1000mg/L無機鹽固體培養基上，固體培養基配方為:每升去離子水中含 1.50 g K2HPO4^0.50 g KH2PO4^0.20 g MgSO4X 7H20、1.00 g NaClU.00 g(NH4)2SO4, 20.0Og瓊脂， pH 7.0，30°C恒溫培養3天。3天后從以上的無機鹽固體培養基上挑取單菌落，于LB固體培養基中劃線分離純化，LB固體培養基配方:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，瓊脂20.00，去離子水1000ml, pH 7.0。將純化后的單菌分別接種至含PEG1000濃度為5000mg/L的LB液體培養基中，LB培養基配方為:酵母膏5.00，蛋白胨10.00，NaCl 10.00，去離子水1000ml, pH 7.0，于30°C、160/min振蕩培養至菌體生長對數后期，即0D600 乂 2.5。將得到的培養液在離心力6000g下離心3min，棄上清液，用pH7.0的lOOmmol/L磷酸緩沖液PBS沖洗2次，再用IOOml無機鹽液體培養基重懸，再往該重懸液中加入0.50g PEG1000,于30°C、160r/min下振蕩18 h，離心去除菌體，用LC-MS分析驗證菌株對PEG1000是否有水解能力。選取水解能力較高的菌株進行后續試驗。將降解菌株接種于LB固體培養基上，30°C恒溫培養30h后觀察菌落形態,用光學顯微鏡觀察菌體形態(1000X)。菌株的生理生化鑒定按照《常見細菌系統鑒定手冊》進行。其菌落圖片見圖1，特征為圓形，邊緣光滑，鑒定為無色桿菌屬sp.),命名為PEGHB-04，主要生物學特性為格蘭氏陰性，結晶紫染色照片如圖2所示，桿狀，無芽孢，大小0.8^1.3X0.5^0.6 μ m ;對明膠水解、淀粉水解、接觸酶呈陽性；對硝酸鹽還原、M.R試驗、V.P試驗、吲哚試驗呈陰性。實施例2菌株PEGHB-04水解聚乙二醇的方法 將菌株PEGHB本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一株聚乙二醇水解無色桿菌（Achromobacter?sp.）菌株PEGHB?04，其保藏編號為CGMCC?NO.7142。
【技術特征摘要】
1.一株聚乙二醇水解無色桿菌sp.)菌株PEGHB-04,其保藏編號為CGMCC N0.7142。2.權利要求1所述的無色桿菌PEGHB-04在聚乙二醇水解中的應用。3.權利要求1所述的無色桿菌PEGHB-04水解聚乙二醇的方法，包括如下步驟: 1)將純化得到的菌株挑至誘導培養基中，于30°C、160r/min振蕩培養至菌體生長對數后期，即 0D600 ≈ 2.5 ； 2)將步驟I)得到的培養液在離心力6000g下離心3min,棄上清液,加入等體積的100mmoI/L, pH7.0的磷酸緩沖液PBS搖勻后，在離心力6000下離心3min，以此方法沖洗2次，然后用IOOml無機鹽液體培養基重懸； 3...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳立偉，李根，蔡天明，胡江，張金，楊倩，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：
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