一種產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KL1活菌制劑的制備方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)涉及一種產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KL1活菌制劑的制備方法，適用于家禽畜牧業(yè)中飼用功能性活菌制劑等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)利用篩選自藏靈菇中的產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KL1菌株，經(jīng)過(guò)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)、高密度發(fā)酵、離心濃縮、加入凍干保護(hù)劑、預(yù)凍和冷凍干燥等工序制備活菌制劑。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)利用全自動(dòng)發(fā)酵罐優(yōu)化發(fā)酵條件，并利用馬鈴薯粉漿作為凍干保護(hù)基質(zhì)，確定凍干保護(hù)劑較優(yōu)組合配方，使KL1菌株的活菌數(shù)量可達(dá)1010CFU/g以上，存活率達(dá)到85％以上。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)制備的活菌制劑價(jià)格低廉，活菌含量高，可作為家禽飼料添加劑，具有雞生長(zhǎng)速度快、飼料用量省、少生病等特點(diǎn)。它不僅有降低雞蛋膽固醇的效果，而且具有調(diào)節(jié)雞的腸道菌群平衡作用，對(duì)雞白痢有較好預(yù)防和治療作用。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑的制備方法，適用于家禽畜牧業(yè)中飼用功能性活菌制劑等微生態(tài)制劑的生產(chǎn)。
技術(shù)介紹
本專(zhuān)利技術(shù)涉及的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KLl是從開(kāi)菲爾粒中分離純化出來(lái)的一種具有降低膽固醇作用的乳酸菌。“藏靈燕”(Tibetan Kefir, TK)又稱(chēng)開(kāi)菲爾粒，19世紀(jì)被人類(lèi)發(fā)現(xiàn)。開(kāi)菲爾粒起源于俄羅斯北高加索地區(qū)，當(dāng)?shù)啬撩駥⑴Ｈ榛蛏窖蛉樽⑷胙蚱た诖?jīng)自然發(fā)酵生產(chǎn)酸乳酒，其殘留物再補(bǔ)加牛乳或山羊乳繼續(xù)發(fā)酵，經(jīng)長(zhǎng)期發(fā)酵后在皮口袋中形成不規(guī)則顆粒狀物體，即為開(kāi)菲爾粒。此后人們便直接將開(kāi)菲爾粒添加到牛乳中，使之發(fā)酵成具有爽快酸味和起泡性的保健飲料，即為開(kāi)菲爾。開(kāi)菲爾具有多種保健功效。開(kāi)菲爾中的活菌對(duì)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌等病原菌的生長(zhǎng)有強(qiáng)烈抑制作用；其中的酵母菌對(duì)結(jié)核桿菌、大腸桿菌有較強(qiáng)抗菌活性。故開(kāi)菲爾對(duì)腸道疾病、肺結(jié)核有很好療效。此外，開(kāi)菲爾中的乳酸菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，如胞外多糖、膽鹽水解酶等能有效預(yù)防腫瘤和高血脂癥的發(fā)生。在藏靈菇的黏多糖基質(zhì)中微生物菌相主要以乳酸菌、酵母菌及少量醋酸菌為基礎(chǔ)的小生態(tài)系。本專(zhuān)利技術(shù)所用干酪乳桿菌KLl是從藏靈菇中分離純化出來(lái)的一種益生乳酸菌，可在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量高活力的膽鹽水解酶，經(jīng)過(guò)體外牛津杯試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明有降低機(jī)體血清總膽固醇含量的功效。其降低膽固醇機(jī)理是緣于干酪乳桿菌KLl代謝產(chǎn)生的膽鹽水解酶(Bile Salt Hydrolase, BSH)。BSH是腸道中的雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬中的多種乳酸細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。大量實(shí)驗(yàn)證明，膽鹽水解酶能在肝腸循環(huán)中將結(jié)合膽鹽分解，產(chǎn)生氨基酸與溶解度較低的游離膽鹽。后者能與膽固醇結(jié)合形成沉淀復(fù)合物而排出體外，從而降低血清總膽固醇的含量。早在1963年人們就證實(shí)攝取含有某種乳桿菌或雙歧桿菌發(fā)酵的酸奶具有降低血清膽固醇含量的功效。迄今為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)乳酸菌降膽固醇作用機(jī)理的研究尚存在不同觀點(diǎn)，主要集中于以下三點(diǎn):(1)乳酸菌菌體細(xì)胞直接吸收同化膽固醇；(2)乳酸菌的膽鹽水解酶活性使結(jié)合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽，后者溶解度下降與膽固醇發(fā)生共同沉淀作用；(3)其他理論，如吸收同化與共沉淀聯(lián)合作用。目前，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)各種活菌制劑制備方法的專(zhuān)利較多，如江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司唐寶英和朱曉慧申請(qǐng)的“酪酸菌活菌制劑及其制備方法”(CN101032527)是由酪酸菌制備的人獸兩用活菌制劑；上海信誼藥業(yè)有限公司陳彬華和姚義強(qiáng)申請(qǐng)的“雙歧三聯(lián)活菌制劑及制備方法”(CN98110623.4)是由兩歧雙歧桿菌、嗜酸乳酸桿菌和糞鏈球菌冷凍干燥活菌粉作為活性成份與保護(hù)劑組成的；上海環(huán)偉生物科技有限公司張琴和陳建呂申請(qǐng)的“一種復(fù)合微生物活菌制劑及其制備方法和應(yīng)用”(ZL200810034746)是利用片球菌、酵母菌和芽孢桿菌分別液體擴(kuò)大培養(yǎng)，然后按所需比例混合，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵、干燥、粉碎制得的一種復(fù)合微生物活菌制劑。但關(guān)于利用分離篩選自藏靈菇中的產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KLl制備活菌制劑，利用自動(dòng)發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，以及利用馬鈴薯粉漿保存生物制劑中活菌的方法尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和專(zhuān)利報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供一種利用產(chǎn)膽鹽水解酶的干酪乳桿菌KLl菌種制備活菌制劑的方法。本專(zhuān)利技術(shù)是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:所述方法中，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei) KLl分離篩選自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏靈菇(又稱(chēng)開(kāi)菲爾粒)，并已于2006年9月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏號(hào)為=CGMCC N0.1809(菌株KLl)。在含有碳酸鈣和納他霉素的MRS選擇性培養(yǎng)基上,干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KLl菌株的菌落大小2 3mm，表面粗糙如雪花狀，邊緣不規(guī)則，無(wú)光澤，扁平，灰白色，半透明，菌落有較高黏性；個(gè)體形態(tài)呈桿狀，長(zhǎng)短不等，短鏈狀排列，有時(shí)菌體呈球形，G+無(wú)芽孢桿菌。所述方法中，將脫脂乳試管保種的干酪乳桿菌KLl菌株以新鮮滅菌脫脂乳于37°C培養(yǎng)12h，至脫脂乳凝固，如此活化2 3代后，冷藏備用。所述方法中，在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將活化好的菌液以2% (V/V，體積分?jǐn)?shù))的接種量移種至改良MRS培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)12h，得到擴(kuò)大培養(yǎng)液。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件。將2L改良MRS培養(yǎng)基加入到5L全自動(dòng)發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵罐滅菌系統(tǒng)于115°C滅菌15min，利用冷水機(jī)將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基冷卻至發(fā)酵溫度。將KLl菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液按3% (V/V，體積分?jǐn)?shù))的接種量移種至發(fā)酵罐中，利用發(fā)酵罐自動(dòng)控溫系統(tǒng)維持發(fā)酵溫度為40°C，發(fā)酵過(guò)程中以流加10 % (W/V，質(zhì)量體積比濃度)的滅菌N%C03溶液控制發(fā)酵液pH6.4，攪拌轉(zhuǎn)速為55r/min，發(fā)酵20h，得到發(fā)酵液。上述方法中，改良MRS培養(yǎng)基成分:葡萄糖10g、大豆蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母干粉5g、朽1檬酸二銨2g、磷酸氫二鉀2g、乙酸鈉5g、七水合硫酸鎂0.58g、四水合硫酸猛0.25g、吐溫 _801mL、蒸餾水 IOOOmL,調(diào)節(jié) pH 為 6.4。上述方法中，5L發(fā)酵罐由上海高機(jī)生物工程有限公司生產(chǎn)，其型號(hào)為B10F6005GBN。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，將2L發(fā)酵液于4°C條件下，5000r/min離心15min,棄上清液,收集得到菌泥。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，將收集的菌泥平均加入2只盛有IOOmL馬鈴薯粉漿(凍干保護(hù)基質(zhì))的600mL凍干瓶中，加入3.5%谷氨酸鈉、2.0%脫脂奶粉和1.5%甘油作為凍干保護(hù)劑，混合均勻后，得到濃縮活菌制劑。上述方法中，采用單因素多水平試驗(yàn)，確定干酪乳桿菌KLl的凍干保護(hù)劑較優(yōu)組合配方為(W/ν，質(zhì)量體積比濃度):3.5%谷氨酸鈉+2.0%脫脂奶粉(伊利)+1.5%甘油(V/V,體積分?jǐn)?shù))。上述方法中，將新鮮去皮馬鈴薯以九陽(yáng)牌食物料理機(jī)打漿，即成為馬鈴薯粉漿。 所述方法中，將濃縮活菌制劑于_34°C預(yù)凍15h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍活菌制劑。所述方法中，在上述試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用6L LABC0NC0真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó))將預(yù)凍活菌制劑于凍干溫度_55°C、真空度0.16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到凍干活菌制劑。所述方法中，所得產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑的活菌數(shù)量可達(dá)1010CFU/g以上，菌種存活率可達(dá)85%以上。此種活菌制劑由于用馬鈴薯粉漿作為凍干保護(hù)基質(zhì)，使產(chǎn)品價(jià)格低廉，活菌含量高，可作為家禽飼料添加劑，具有雞生長(zhǎng)速度快、飼料用量省、少生病等特點(diǎn)。它不僅有降低雞蛋膽固醇的效果，而且具有調(diào)節(jié)雞的腸道菌群平衡作用，對(duì)雞白痢有較好預(yù)防和治療作用。上述方法得到的產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑及其制備方法屬于本專(zhuān)利技術(shù)保護(hù)范圍。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)作進(jìn)一步說(shuō)明而不限制本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無(wú)特別說(shuō)明，均為體積分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1、產(chǎn)膽鹽水解酶干酪乳桿菌KLl活菌制劑的制備方法1、菌種的活化和擴(kuò)大培養(yǎng)將脫脂乳試管保種的干酪乳桿菌KL本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種利用菌株KL1CGMCC?No.1809為干酪乳桿菌(Lactobacillus?casei)的產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌制備活菌制劑的方法，其特征在于：將干酪乳桿菌KL1擴(kuò)大培養(yǎng)液按3％的接種量移種至2L改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌和高密度發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵液pH6.4，攪拌轉(zhuǎn)速55r/min，發(fā)酵時(shí)間20h，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液于4℃、5000r/min離心15min，收集得到菌泥；在600mL凍干瓶中按離心前發(fā)酵液1/10體積的量，加入馬鈴薯粉漿作為凍干保護(hù)基質(zhì)，再加入3.5％谷氨酸鈉、2.0％脫脂奶粉和1.5％甘油的凍干保護(hù)劑與收集的菌泥，混合均勻后，得到濃縮發(fā)酵劑；將每個(gè)凍干瓶裝量為100mL的濃縮發(fā)酵劑于?34℃預(yù)凍15h至完全凍結(jié)狀態(tài)，得到預(yù)凍活菌制劑；利用美國(guó)產(chǎn)6L?LABCONCO真空冷凍干燥機(jī)將預(yù)凍活菌制劑于?55℃、真空度0.16mBar的條件下，凍干48h至完全干燥狀態(tài)，得到干酪乳桿菌KL1凍干活菌制劑。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用菌株KL1CGMCC N0.1809為干釀乳桿菌(Lactobacillus casei)的產(chǎn)膽鹽水解酶乳酸菌制備活菌制劑的方法，其特征在于:將干酪乳桿菌KLl擴(kuò)大培養(yǎng)液按3%的接種量移種至2L改良MRS發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用5L全自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌和高密度發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度40°C，發(fā)酵液pH6.4，攪拌轉(zhuǎn)速55r/min，發(fā)酵時(shí)間20h，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液于4°C、5000r/min離心15min，收集得到菌泥；在600mL...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉慧，謝遠(yuǎn)紅，張紅星，周妍，熊利霞，高秀芝，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：北京農(nóng)學(xué)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：