本發明專利技術涉及一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法。本發明專利技術依次經過生產用毒種制備、制苗材料制備、IBDV細胞病毒液制備、成品檢驗、配苗及分裝、凍干等步驟制得IBDV活疫苗，本發明專利技術從接種材料、培養液改良、培養環境維護、凍干保護劑組分等方面，對現有的生產方法進行了改良，獨創了新的傳代細胞培養方法。此外，還包括通過本發明專利技術方法制得的IBDV活疫苗在預防雞傳染性法氏囊病中的應用。由本發明專利技術方法制備得到的IBDV活疫苗具有耐熱性能好，病毒滴度高，穩定性好，適合進行大規模疫苗生產的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術為，屬于生物疫苗領域。
技術介紹
雞傳染性法氏囊病(Infeetious Bursal Disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infeetious Bursal Disease Virus, IBDV)引起的一種高度接觸性傳染病,是目前危害世界養禽業的主要傳染病之一，主要侵害雛雞和青年雞的法氏囊器官，該病的危害不僅直接造成雞只死亡、增加淘汰率、影響增重，更重要的是破壞法氏囊中的B淋巴細胞，導致免疫抑制，使病雞更易感其它疫病，對疫苗接種的免疫應答下降或喪失。由于IBD在外界環境中較為穩定，采取消毒和隔離措施來控制本病不易達到目的。本病至今仍無有效的治療方法，預防該病最行之有效的辦法就是疫苗的接種。目前，市售的法氏囊疫苗絕大多數為雞胚組織苗，相對于細胞苗而言，其具有成本高、產品質量批間差較大、且容易產生雞源性潛在疾病的感染等缺點。2011年初，哈藥集團生物疫苗有限公司分離了一株法氏囊病毒(命名為:H11株)，其具有在雞胚成纖維細胞上增值的特性，基于此，本研究針對該毒種良好的細胞噬性，從接種材料、培養液改良、培養環境維護、凍干保護劑組分等方面，對現有的生產方法進行了改良，獨創了新的傳代細胞培養方法，按照本專利技術方法制備得到的活 疫苗具有耐熱性能好，病毒滴度高，穩定性好，適合進行大規模疫苗生產的特點，故而，申請人提出對優化過接種材料、培養液改良、培養環境維護、凍干保護劑組分等條件的新生產方法進行專利保護。
技術實現思路
本專利技術的目的為提供一種利用傳代雞胚成纖維細胞(CEF)制備傳染性法氏囊病毒(IBDV)活疫苗的方法。按照本專利技術方法制備得到的活疫苗相較于雞胚組織苗，病毒含量、產品合格率和免疫攻毒保護率都有顯著的提高，疫苗的耐熱性能顯著，并且半成品陽性雜檢率和單位體積的生產成本都有明顯的降低。本專利技術的，其特征在于包括以下步驟:(1)生產用毒種制備①毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，_20°C保存；②毒種鑒定符合生產用種子標準；③毒種保存在-20°c以下保存，不超過9個月；④毒種繼代不超過3代；(2)傳代細胞的制備取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，傳代培養，傳代次數不超過5代；(3)傳染性法氏囊病毒病毒液的制備①接種棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代培養后的單層雞胚成纖維細胞；37°C吸附I小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養；②培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5moI/LNaHCO3,培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；③病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在-15°C以下保存，應不超過I個月；(4)半成品檢驗①無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長；②病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105_ 5EID50,方可配苗；(5)配苗及分裝①凍干保護劑的制備A液:明膠5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去離子水定容至100ml，116°C，高壓滅菌30min, 15°C保存,不超過7天；B液:維生素C0.lg、山梨醇2g、谷氨酸鈉1.5g，去離子水定容至100ml，0.22μπι濾膜過濾除菌，4°C保存，不超過3天；②分裝將保護劑A液、B液按1:1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1:1體積比加入保護劑中，定量分裝；(6)凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。優選的，所述毒種為傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株，所述的適應株命名為Hll株，分類命名為傳染性法氏囊病毒，保藏編號為CGMCC N0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。進一步的，本專利技術還提出了根據本專利技術所述的方法制備得到的傳染性法氏囊病毒活疫苗。及所述的傳染性法氏囊病毒活疫苗在制備預防雞傳染性法氏囊病藥物中的應用。通過比較試驗發現，本專利技術利用傳代雞胚成纖維細胞生產疫苗的新方法比利用雞胚生產疫苗的老方法具有以下優點:1.改進的細胞培養方法,病毒含量高于雞胚培養和普通原代CEF培養方法。2.病毒制造原料為傳代雞胚成纖維細胞，使產品質量均一，生產成本顯著降低。3.添加了還原性谷胱甘肽的改良型細胞培養液,使得病毒在增殖速度和產量上都優于目前雞胚培養方法和普通原代CEF培養方法。4.病毒培養過程添加NaHCO3,為病毒的增殖提供穩定的pH環境，延長了病毒增殖曲線高峰區的時間。 5.全過程不添加任何抗生素。6.優化的耐熱凍干保護劑組分，使成品保存條件為2 8°C保存。7.細胞苗的免疫效力不低于利用雞胚生產的傳染性法氏囊活疫苗。具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本專利技術，本專利技術的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本專利技術的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本專利技術的精神和范圍下可以對本專利技術技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本專利技術的保護范圍內。材料和試劑:毒株:傳染性法氏囊病毒雞胚成纖維細胞適應株Hl I株，保藏編號為CGMCCN0.6910，保藏日期為2012年11月29日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院。材料:9 10日齡SPF雞胚為哈藥集團生物疫苗有限公司SPF雞場種蛋在本研發中心孵化、雞胚原代成纖維細胞由哈藥集團生物疫苗有限公司研發中心制備、0.22 μ m濾膜購自PALL公司。試劑:還原型谷胱甘肽購自Sigma、胰酶購自Gibco、明膠購自Sigma、鹿糖購自國藥化學試劑有限公司、糊精購自上海酶聯生化試劑有限公司、胰蛋白胨購自Amresco、維生素C購自SIGMA、山梨醇購自Amresco、谷氨酸鈉購自MBCHEM實施例1利用傳代雞胚成纖維細胞生產IBDV Hll活疫苗(I)生產用毒種制備①毒種繁殖將毒種Hll株(保藏編號為CGMCC N0.6910)用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°c吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，-20°C保存；②毒種鑒定符合生產用種子標準；③毒種保存在_20°C以下保存，不超過9個月；④毒種繼代不超過3代；(2)傳代細胞的制備取9 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟：（1）生產用毒種制備①毒種繁殖將傳染性法氏囊病毒毒種用滅菌生理鹽水作103～104倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37℃吸附1小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37℃，5%CO2條件下，培養3～4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于?20℃冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，?20℃保存；②毒種鑒定符合生產用種子標準；③毒種保存在?20℃以下保存，不超過9個月；④毒種繼代不超過3代；（2）傳代細胞的制備取9～10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37℃培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，傳代培養，傳代次數不超過5代；（3）傳染性法氏囊病毒病毒液的制備①接種棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作103～104倍稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代培養后的單層雞胚成纖維細胞；37℃吸附1小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37℃培養；②培養病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加入總體積0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培養3～4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；③病毒液收獲將裝有病毒液的培養瓶，放入?20℃冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，在?15℃以下保存，應不超過1個月；（4）半成品檢驗①無菌檢驗每組病毒液分別取樣，應無菌生長；②病毒含量測定每0.2ml病毒含量應為105.5EID50，方可配苗；（5）配苗及分裝①凍干保護劑的制備A液：明膠5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去離子水定容至100ml，116℃，高壓滅菌30min，15℃保存，不超過7天；B液：維生素C0.1g、山梨醇2g、谷氨酸鈉1.5g，去離子水定容至100ml，0.22μm濾膜過濾除菌，4℃保存，不超過3天；②分裝將保護劑A液、B液按1︰1體積混合均勻，將檢驗合格的細胞病毒液，按1︰1體積比加入保護劑中，定量分裝；（6）凍干分裝后迅速進行冷凍真空干燥。...
【技術特征摘要】
1.一種利用傳代雞胚成纖維細胞制備傳染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)生產用毒種制備 ①毒種繁殖 將傳染性法氏囊病毒毒種用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋后，接種單層雞胚成纖維細胞；棄掉細胞培養液，按培養液體積的1/10接毒，37°C吸附I小時，加入培養液，并向其添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液；37°C，5%C02條件下，培養3 4天，待80%細胞出現特異性病變時收獲病毒液；于_20°C冰柜中反復凍融3次，收獲于滅菌容器內，_20°C保存； ②毒種鑒定 符合生產用種子標準； ③毒種保存 在-20°C以下保存，不超過9個月； ④毒種繼代 不超過3代； (2)傳代細胞的制備 取9 10日齡SPF雞胚，制備雞胚成纖維細胞，37°C培養，待細胞長成單層后，用質量分數為0.2%的胰酶溶液進行消化，加入原體積2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均勻，再取原體積細胞液至另外細胞培養瓶中培養，直至長成單層，傳代培養，傳代次數不超過5代； (3)傳染性法氏囊病毒病毒液的制備 ①接種 棄掉細胞培養液，取生產用種毒，用滅菌生理鹽水作IO3 IO4倍稀釋，按培養液體積的1/10接種傳代培養后的單層雞胚成纖維細胞；37°C吸附I小時，加入培養液，并向其中添加1%體積的10%還原型谷胱甘肽溶液，輕輕混勻，37°C培養； ②培養 病毒接種24小時后，每6小時向培養液中加...
【專利技術屬性】
技術研發人員：劉洪斌，張楊，楊萬秋，丁國杰，李東偉，楊朋欣，焦利紅，孫心，李敏，張明艷，
申請(專利權)人：哈藥集團生物疫苗有限公司，
類型：發明
國別省市：
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