一種豬胎兒成纖維細胞的單細胞培養方法技術

本發明專利技術涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種豬胎兒成纖維細胞的單細胞培養方法。該單細胞培養方法，包括：步驟A：獲得成纖維細胞懸液和飼養層細胞；步驟B：將飼養層細胞以微滴形式接種至培養皿，培養至飼養層細胞密度在微滴內100％匯合，獲得飼養層細胞微滴；步驟C：將成纖維細胞懸液接種至具有飼養層細胞微滴的培養皿，經細胞培養，獲得單細胞克隆。本發明專利技術提供的單細胞培養方法獲得的克隆細胞基因組完全一致，有利于提高轉基因豬的特異性，有利于轉基因豬克隆效率的評價，以及特定均一轉基因豬品系的建立。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及細胞培養
，特別涉及一種豬胎兒成纖維細胞的單細胞培養方 法。
技術介紹
中國是世界上養豬規模最大的國家，但豬生產水平遠低于歐美養豬發達國家。短 期內傳統的育種手段很難在豬生產性能方面取得大的進展，但是轉基因技術打破了遠緣有 性雜交的束縛，實現了不同物種生物體之間的基因交流，從而可以最大限度的利用和創造 遺傳變異，改良家畜的性狀，創造新的家畜品種轉基因動物為豬遺傳育種提供了新的技術 手段，可大大加速遺傳改良的速度，尤其是轉基因體細胞核移植技術的出現，為轉基因技術 在豬改良育種中的應用提供了技術支撐。 豬胎兒成纖維細胞是豬體細胞轉基因克隆的重要工具細胞，目前用于豬轉基因克 隆的胎兒成纖維細胞是原代培養分離的混合胎兒體細胞系。在該混合細胞系中基因組中通 過轉染隨機插入帶有篩選標記的外源基因，經過加壓篩選獲得具有唯一篩選標記的轉基因 混合細胞。 但是，采用上述混合細胞系經加壓篩選獲得的細胞具有一定的缺陷：一方面由于 加壓篩選只能得到具有篩選標記的細胞，與其基因組的均一性無關，再將這些經過隨機重 組的混合細胞分別通過體細胞核移植技術轉入受體卵細胞中進行個體激活發育，得到的個 體將是具有不同重組位點的轉基因豬。另一方面定點轉基因的脫靶效應會導致即使基因組 完全一致的細胞，產生多種轉基因的可能，而這種混合細胞的體細胞克隆產生的后代將嚴 重不均一，可能有這樣或者那樣的表型，甚至達不到轉基因的效果，沒有任何新表型。 因此，建立一種有效的胎兒成纖維細胞單細胞培養技術將有利于提高轉基因豬的 特異性，有利于轉基因豬克隆效率的評價，以及特定均一轉基因豬品系的建立。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術提供了 一種成纖維細胞的單細胞培養方法。該單細胞培養方法 獲得的克隆細胞基因組完全一致，有利于提高轉基因豬的特異性，有利于轉基因豬克隆效 率的評價，以及特定均一轉基因豬品系的建立；本專利技術提供的單細胞培養方法獲得的克隆 細胞無需進行加壓篩選，因此，可簡化轉基因動物的生產工作。 為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案： 本專利技術提供了一種成纖維細胞的單細胞培養方法，包括如下步驟： 步驟A:獲得成纖維細胞懸液和飼養層細胞； 步驟B:將飼養層細胞以微滴形式接種至培養皿，培養至飼養層細胞密度在微滴 內100%匯合，獲得飼養層細胞微滴； 步驟C:將成纖維細胞懸液接種至具有飼養層細胞微滴的培養皿，經細胞培養，獲 得單細胞克隆。 在本專利技術中，由于飼養層細胞微滴既能夠提供細胞因子，又占用少量培養皿面積， 達到了既能給成纖維細胞提供生長所需的良好培養環境，又能保證有足夠的空間供成纖維 細胞增殖形成獨立的優質細胞克隆的目的，從而有利于單細胞克隆的獲得，可用于均一、無 篩選標記的轉基因動物的生產。 作為優選，成纖維細胞懸液的細胞濃度為5~10個/mL。 作為優選，成纖維細胞懸液的接種量為10~15mL/皿。 在本專利技術提供的一些實施例中，步驟C中細胞培養為38°C、5% 0)2恒溫培養8~ 11天。 作為優選，飼養層細胞的接種量為300~500yL/微滴。 作為優選，飼養層細胞微滴在培養皿中的密度為10~12個/皿。 在本專利技術提供的一些實施例中，步驟B中飼養層細胞的培養條件為37°C、5%C02 恒溫培養。 作為優選，成纖維細胞為3代以內的成纖維細胞。 在本專利技術提供的一些實施例中，成纖維細胞為豬胚胎成纖維細胞。但成纖維細胞 的來源并非限定于此，其它動物來源的成纖維細胞的單細胞培養同樣適用于本專利技術。 在本專利技術提供的一些實施例中，飼養層細胞的制備方法為：取胚胎成纖維細胞，經 絲裂霉素C處理2. 5h，去除絲裂霉素C，加入胰酶消化液孵育，終止消化，獲得飼養層細胞。 本專利技術提供了一種成纖維細胞的單細胞培養方法。該單細胞培養方法，包括：步驟 A:獲得成纖維細胞懸液和飼養層細胞；步驟B:將飼養層細胞以微滴形式接種至培養皿，培 養至飼養層細胞密度在微滴內100%匯合，獲得飼養層細胞微滴；步驟C:將成纖維細胞懸 液接種至具有飼養層細胞微滴的培養皿，經細胞培養，獲得單細胞克隆。本專利技術至少具有如 下優勢之一： 本專利技術提供的單細胞培養方法獲得的克隆細胞基因組完全一致，有利于提高轉基 因豬的特異性，有利于轉基因豬克隆效率的評價，以及特定均一轉基因豬品系的建立； 本專利技術提供的單細胞培養方法獲得的克隆細胞無需進行加壓篩選，因此，可簡化 轉基因動物的生產工作?！靖綀D說明】 圖1示由本專利技術培養的豬胎兒成纖維細胞單細胞克??； 圖2示定量PCR標準曲線（GFP基因）； 圖3示本專利技術單細胞培養克隆基因組GFP拷貝數與DNA質量的關系； 圖4示G418篩選克隆基因組GFP拷貝數與DNA質量的關系?！揪唧w實施方式】 本專利技術公開了一種成纖維細胞的單細胞培養方法，本領域技術人員可以借鑒本文 內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人 員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本專利技術。本專利技術的方法及應用已經通過較佳實 施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
技術實現思路
、精神和范圍內對本文所述的方法 和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本專利技術技術。 本專利技術提供的成纖維細胞的單細胞培養方法中所用材料、試劑和儀器均可由市場 購得。 下面結合實施例，進一步闡述本專利技術： 實施例1豬胚胎的獲得 懷孕30天實驗用母豬用戊巴比妥鈉耳靜脈注射劑量為1. 4mL/Kg，先快速注射全 劑量的50%，然后緩慢注射，10分鐘內注射麻醉，使用新潔爾滅在腹部消毒，然后在腹正中 打開切口，用腸鉗夾封閉妊娠子宮的兩端，子宮內可觸及若干個雞蛋樣胚胎。絲用線結扎子 宮兩端，切斷，縫扎子宮殘端，縫合線關閉腹腔。在超凈工作臺中內剖開子宮，取出胚胎，用 含1 %抗生素的37°C預熱的PBS洗滌三遍，置于無菌瓶皿，除去頭、四肢及內臟。 實施例2豬胚胎成纖維細胞的分離與培養 將實施例1獲得的胚胎組織切成1_X1_X1_大小的碎塊，利用滅菌眼科剪將 組織剪碎至糊狀，將其涂布到細胞培養皿底部，置于38°C、飽和濕度的C02培養箱中放置4h 后，加入細胞培養液（DMEM+10 %胎牛血清+1 %雙抗+1 %非必需氨基酸），盡量避免組織塊 漂浮，繼續以上述條件進行培養，每隔72h更換培養液一次，在第8天成纖維樣細胞開始從 組織塊孵出。加入37°C的2. 5g/L胰蛋白酶，置C02培養箱內消化30min。100目篩網過濾， lOOOrpm離心5min，收集細胞。以PBS液洗滌1次，再用含10%小牛血清的DMEM培養液洗 滌2次，在37°C、5%C02培養箱中傳代培養。原代分離的細胞記錄為P0代，按1:4傳代后 記錄P1代，約四天長到90%以上匯合度可再次傳代或凍存，下一代為P2代，以此類推。 實施例3飼養層細胞的制備 1)原代小鼠胚胎成纖維細胞分離培養： 選取6-10周齡雌雄鼠1:1合籠，次晨和下午分別查陰栓1次，見陰栓者計為妊娠 〇.5d。取妊娠12. 5-14. 5d孕鼠。處死妊娠小鼠，在75%醫用酒精中浸兩分鐘。取出孕鼠， 超凈臺內無菌取出子宮，置于盛有PBS的90mm培養皿中，PBS清洗1次，吸去廢液。在體式 鏡下用尖鑷子撕開子宮壁和胎膜，取出胎鼠，去除胎鼠頭、尾、本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種成纖維細胞的單細胞培養方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟A：獲得成纖維細胞懸液和飼養層細胞；步驟B：將所述飼養層細胞以微滴形式接種至培養皿，培養至飼養層細胞密度在微滴內100％匯合，獲得飼養層細胞微滴；步驟C：將所述成纖維細胞懸液接種至具有所述飼養層細胞微滴的培養皿，經細胞培養，獲得單細胞克隆。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李秋艷，張佳，李志遠，付怡靜，
申請(專利權)人：中國農業大學，
類型：發明
國別省市：北京;11