木聚糖酶腸道定向表達載體及其細胞系制造技術

本發明專利技術涉及木聚糖酶腸道定向表達載體及其細胞系，屬于生物技術領域。將XynB基因插入真核表達載體pcDNA3.1(-)，并構建慢病毒重組載體Lanti4-blockit-RELMβ-XynB-myc-GFP，轉染原代培養的豬胎兒成纖維細胞，構建腸道定向表達XynB酶蛋白的真核細胞系。為進一步開展體細胞核移植克隆轉XynB基因胚胎，培育高飼料利用率、低污染物排放的轉基因豬新品種及其相關生物學科研與生產領域提供必要的轉基因生物材料和關鍵技術體系支撐。

【技術實現步驟摘要】
一、
本專利技術涉木聚糖酶腸道定向表達載體及其細胞系，屬于生物
二、
技術介紹
環境友好型養殖業是畜牧業可持續健康發展的新方向。改革開放以來，隨著我國國民經濟的全面、快速發展，人民生活需求水平的不斷提高，我國畜牧產業規模化取得了空前的發展。然而，隨著畜牧場規模化、集約化和機械化程度的提高，畜禽糞便已成為一個不可忽視的污染源。同時，我國是一個養殖大國，飼料產量居世界第二，由于近年來我國養殖業的快速發展，加劇了人畜爭糧矛盾，而且耕地面積日益減少，使糧食問題更加嚴峻。因此，增加飼料的營養價值，提高飼料的利用率和轉化率，節約糧食資源就顯得尤為重要。木聚糖酶作為一種環保型飼料酶制劑，應用于飼料中提高了飼料的營養價值，突破了飼料資源開發利用的局限，增強了動物的生產和抗病能力，減少了動物排泄物造成的污染，在發展環境友好型養殖業中具有重要的意義和價值。木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物半纖維的重要組分，廣泛存在于植物細胞壁中，它占植物碳水化合物總量的1/3，在自然界中是繼纖維素之后含量第二豐富的生物質資源。木聚糖可阻止細胞內養分釋放、增加食糜黏度、阻礙飼料營養物質與消化液的接觸、增加腸道不動水層厚度，使消化器官代償性增加，并破壞腸道正常結構和微生態平衡，影響營養物質的消化吸收，因此木聚糖是一種典型的抗營養因子，因豬消化道內缺乏相應的內源性消化酶分解飼料中這類抗營養因子，用作豬飼料的玉米、豆粕中的木聚糖難以被有效利用，被直接排出體外，導致了飼料資源的浪費和嚴重的環境污染。內切β-木聚糖酶（endo-β-XynB）是水解木聚糖的關鍵酶，目前，國內外已經獲得的木聚糖酶產酶微生物主要來源于自然界中的桿菌、黑曲霉菌、青霉菌屬、木霉屬以及放線菌屬，大部分真菌源木聚糖酶具有嗜酸性，但細菌來源的最適pHopt均高于5.5，本專利技術選擇研究來源于黑曲霉屬的木聚糖酶基因，其酶蛋白pHopt在5.5左右，酶活性在動物胃的酸性環境中較高。基于以上研究進展，利用木聚糖酶分解植物中木聚糖的生物學特性，綜合現在的分子和細胞生物學手段，采用轉基因手段在目的動物體細胞中導入具有特殊生物學功能的外源木聚糖酶（XynB）基因，可望進一步通過轉基因體細胞克隆技術途徑，獲得腸道中穩定表達和穩定遺傳的轉XynB基因的豬新品種（系）。抵抗素樣分子β（resistin-like?molecule?β）又稱發現于炎癥帶2（Found?in?inflammatory?zone?2，FIZZ2），目前其相關研究主要集中在人類，生物學功能與腸管上皮細胞分化、細胞增殖、腸道免疫應答緊密相關，是研究腸道疾患及其靶向生物治療的新靶標。研究發現，RELMβ基因高度表達于腸道組織。而RELMβ基因啟動子是其高度表達于腸道的關鍵，相關研究表明，RELMβ基因啟動子區包含多個腸上皮特異性轉錄調控因子。人和豬同源性非常高，因此豬RELMβ基因的生物學功能和啟動子結構具有潛在的相似性。本專利技術克隆得到豬RELMβ啟動子序列，并篩選得到活性最強啟動子片段，將其構建成XynB基因的腸道定向表達載體，并進一步轉染體細胞，構建轉XynB基因的豬胎兒成纖維細胞系，解決了轉基因豬體內目的基因在腸道內定向表達及其有效發揮其生物學功能的關鍵技術問題。三、
技術實現思路
技術問題本專利技術的目的是提供木聚糖酶腸道定向表達載體及其細胞系，是專用于生命科學和畜牧科研與生產的環保型的生物制品，可作為開展環境友好型轉基因豬研究提供必要的生物材料及其相關關鍵技術方法參考。技術方案木聚糖酶腸道定向表達載體，是通過以下方法構建而成的：(1)以原核載體pRSETA-XynB為模板，根據XynB基因序列，設計PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho?I酶切位點，在酶切位點與起始位點之間引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn?I酶切位點和Myc-Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：P1:?5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho?IP2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’?Kpn?IPCR?擴增條件為：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32個循環；72℃，5min，PCR擴增片段大小為678bp；將上述PCR終產物與pMD18T連接，得到克隆載體pMD18T-XynB-Myc；(2)將上述克隆載體pMD18T-XynB-Myc用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時用相同限制性內切酶雙酶切pcDNA3.1(-)，將酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)載體片段由T4?DNA連接酶4℃連接過夜，得到XynB真核表達載體pcDNA3.1-XynB-Myc；????(3)根據XynB基因及GFP基因序列，設計PCR反應引物?P3?/?P4?和?P5?/?P6，引物?P3/P4?擴增?XynB-Myc，引物?P5/P6?擴增?GFP，P4有部分序列與GFP基因互補，P5有部分序列與XynB-Myc基因片段互補，P6引物5’端引入終止密碼子TAA；P3:?5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho?IP4:?5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’P5:?5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’P6:?5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn?I以pMD18T-XynB-Myc載體為模板，使用引物P3/P4，擴增XynB-Myc片段，大小為682bp；以質粒pEGFP-C3為模板，使用引物P5/P6，擴增GFP片段，大小為768bp；以上述擴增產物XynB-Myc片段及GFP片段為模板，用引物P3和P6，采用重疊PCR方法將兩種組件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，該融合片段的大小為1398bp，擴增程序為98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32個循環；72℃，10min；將上述PCR終產物XynB-myc-GFP片段與pMD18T?在4℃條件下連接，獲得重組載體pMD18T-XynB-myc-GFP；?(4)將中間載體pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時用同樣的限制性內切酶雙酶切pcDNA3.1(-)，將酶切回收的XynB-myc-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)載體片段采用T4?DNA連接酶4℃連接過夜，獲得真核表達載體pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP；（5）豬RELMβ基因啟動子區目前未見報道，豬和人基因同源性極高，根據Genebank中人RELMβ基因5’側翼區序列AF352731，豬RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端遞減原則，設計PCR正向引物P7-P12，引本文檔來自技高網...

【技術保護點】
木聚糖酶腸道定向表達載體，是通過以下方法構建而成的：(1)以原核載體pRSETA?XynB為模板，根據XynB基因序列，設計PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho?I酶切位點，在酶切位點與起始位點之間引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn?I酶切位點和Myc?Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：P1:?5’?CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT?3’Xho?IP2:5’?GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA?3’?Kpn?IPCR?擴增條件為：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32個循環；72℃，5min，PCR擴增片段大小為678bp；將上述PCR終產物與pMD18T連接，得到克隆載體pMD18T?XynB?Myc；(2)將上述克隆載體pMD18T?XynB?Myc用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時用相同限制性內切酶雙酶切pcDNA3.1(?)，將酶切回收的XynB?Myc目的片段和pcDNA3.1(?)載體片段由T4?DNA連接酶4℃連接過夜，得到XynB真核表達載體pcDNA3.1?XynB?Myc；(3)根據XynB基因及GFP基因序列，設計PCR反應引物?P3?/?P4?和?P5?/?P6，引物?P3/P4?擴增?XynB?Myc，引物?P5/P6?擴增?GFP，P4有部分序列與GFP基因互補，P5有部分序列與XynB?Myc基因片段互補，P6引物5’端引入終止密碼子TAA；P3:?5’?CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT?3’Xho?IP4:?5’?CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT?3’P5:?5’?GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG?3’P6:?5’?GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA?3’Kpn?I以pMD18T?XynB?Myc載體為模板，使用引物P3/P4，擴增XynB?Myc片段，大小為682bp；以質粒pEGFP?C3為模板，使用引物P5/P6，擴增GFP片段，大小為768bp；以上述擴增產物XynB?Myc片段及GFP片段為模板，用引物P3和P6，采用重疊PCR方法將兩種組件融合，得到XynB?Myc?GFP片段，該融合片段的大小為1398bp，擴增程序為98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32個循環；72℃，10min；將上述PCR終產物XynB?myc?GFP片段與pMD18T?在4℃條件下連接，獲得重組載體pMD18T?XynB?myc?GFP；(4)將中間載體pMD18T?XynB?myc?GFP用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時用同樣的限制性內切酶雙酶切pcDNA3.1(?)，將酶切回收的XynB?myc?GFP目的片段和pcDNA3.1(?)載體片段采用T4?DNA連接酶4℃連接過夜，獲得真核表達載體pcDNA3.1(?)?XynB?myc?GFP；（5）豬RELMβ基因啟動子區目前未見報道，豬和人基因同源性極高，根據Genebank中人RELMβ基因5’側翼區序列AF352731，豬RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端遞減原則，設計PCR正向引物P7?P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位點，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位點，擴增不同長度豬RELMβ啟動子片段：　序列5′?3′目的片段大小/bpP7(?842～+215)CTAGCTAGCGAACTTATGACCATGAGGAC1048P8(?793～+215)CTAGCTAGCGATGAAGAGCCACTGAAC1017P9(?574～+215)CTAGCTAGCAAATATGGCCCTAACTCAAC798P10(?182～+215)CTAGCTAGCCTCCCCGATTCTCAAAAC406P11(?147～+215)CTAGCTAGCGCTCCTCCATTCTGACAC371P12(?86～+215)CTAGCTAGCTCTTTCCTTCCCAGCAAC310P13CCGCTCGAGATAATCAGACTGCTCAC　（6）上述擴增得到的RELMβs啟動子片段連接到pMD18T載體，構建中間載體pMD18T?RELMβs，pGL3?Enhancer載體和上述獲得的pMD18T?RELMβs分別經NheⅠ和XhoⅠ雙酶切、凝膠回收，使用T4?DNA連接酶4℃過夜連接，將RELMβs定向克隆到熒光素酶報告基因載體pGL3?Enhancer中，利用雙酶切和測序方法，篩選構建正確的重組pGL?RELMβs基...

【技術特征摘要】
1.木聚糖酶腸道定向表達載體，是通過以下方法構建而成的：
(1)以原核載體pRSETA-XynB為模板，根據XynB基因序列，設計PCR引物P1和P2，P1引物5’端引入Xho?I酶切位點，在酶切位點與起始位點之間引入Kozak序列GCCACC，P2引物5’端引入Kpn?I酶切位點和Myc-Tag序列CAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC：
P1:?5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho?I
P2:5’-GGGGTACCCAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCTGAACAGTGATGGA-3’?Kpn?I
PCR?擴增條件為：98℃，5min；98℃，30s；55℃，30s；72℃，30s；32個循環；72℃，5min，PCR擴增片段大小為678bp；
將上述PCR終產物與pMD18T連接，得到克隆載體pMD18T-XynB-Myc；
(2)將上述克隆載體pMD18T-XynB-Myc用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時用相同限制性內切酶雙酶切pcDNA3.1(-)，將酶切回收的XynB-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)載體片段由T4?DNA連接酶4℃連接過夜，得到XynB真核表達載體pcDNA3.1-XynB-Myc；
(3)根據XynB基因及GFP基因序列，設計PCR反應引物?P3?/?P4?和?P5?/?P6，引物?P3/P4?擴增?XynB-Myc，引物?P5/P6?擴增?GFP，P4有部分序列與GFP基因互補，P5有部分序列與XynB-Myc基因片段互補，P6引物5’端引入終止密碼子TAA；
P3:?5’-CCGCTCGAGGCCACCATGTTTCAACT-3’Xho?I
P4:?5’-CCTTGCTCACCATAGATCCTCTTCT-3’
P5:?5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’
P6:?5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’Kpn?I
以pMD18T-XynB-Myc載體為模板，使用引物P3/P4，擴增XynB-Myc片段，大小為682bp；以質粒pEGFP-C3為模板，使用引物P5/P6，擴增GFP片段，大小為768bp；
以上述擴增產物XynB-Myc片段及GFP片段為模板，用引物P3和P6，采用重疊PCR方法將兩種組件融合，得到XynB-Myc-GFP片段，該融合片段的大小為1398bp，擴增程序為98℃，5min；98℃，30s；52℃，30s；72℃，90s；32個循環；72℃，10min；
將上述PCR終產物XynB-myc-GFP片段與pMD18T?在4℃條件下連接，獲得重組載體pMD18T-XynB-myc-GFP；
(4)將中間載體pMD18T-XynB-myc-GFP用限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切，同時用同樣的限制性內切酶雙酶切pcDNA3.1(-)，將酶切回收的XynB-myc-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)載體片段采用T4?DNA連接酶4℃連接過夜，獲得真核表達載體pcDNA3.1(-)-XynB-myc-GFP；
（5）豬RELMβ基因啟動子區目前未見報道，豬和人基因同源性極高，根據Genebank中人RELMβ基因5’側翼區序列AF352731，豬RELMβ基因cDNA序列NC_010455，按照5’端遞減原則，設計PCR正向引物P7-P12，引物5’端引入NheⅠ酶切位點，反向引物P13，引物5’端引入XhoⅠ酶切位點，擴增不同長度豬RELMβ啟動子片段：
序列5′-3′目的片段大小/bpP7(...

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳哲，王公金，于建寧，徐小波，
申請(專利權)人：江蘇省農業科學院，
類型：發明
國別省市：江蘇;32