大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用。該大豆PHD轉(zhuǎn)錄因子，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，該大豆PHD轉(zhuǎn)錄因子GmPHD6及其編碼基因可用于培育耐逆植物品種特別是耐逆大豆品種，如耐鹽、耐旱大豆。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物
，尤其涉及一種大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
環(huán)境中物理、化學(xué)因素的變化，例如干旱、鹽堿、低溫等脅迫因素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成農(nóng)作物大規(guī)模減產(chǎn)，因此培育耐逆性高的作物是種植業(yè)的主要目標(biāo)之一。目前，應(yīng)用基因工程技術(shù)進(jìn)行育種已經(jīng)成為提高作物耐逆性的重要方法之一。高等植物細(xì)胞具有多條途徑應(yīng)答環(huán)境中的各種逆境脅迫，其中轉(zhuǎn)錄因子起著調(diào)控耐逆相關(guān)效應(yīng)基因表達(dá)的作用。現(xiàn)已在植物中發(fā)現(xiàn)了多類(lèi)與植物耐逆性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，例如:EREBP/AP2中的DREB類(lèi)，bZIP，MYB等等。PHD(Plant Homodomain)類(lèi)具有轉(zhuǎn)錄活性的蛋白廣泛存在于動(dòng)植物以及細(xì)菌、病毒蛋白中，比如哺乳動(dòng)物的CBP類(lèi)蛋白、人的INGl家族、酵母Yng2p蛋白、病毒MIRl蛋白。PHD類(lèi)蛋白結(jié)構(gòu)域是C4HC3類(lèi)的鋅指結(jié)構(gòu)，其功能主要為以下幾類(lèi):(I)作為乙酰化或去乙?；竻⑴c染色質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控；(2)作為E3泛素連接酶參與蛋白降解；(3)作為PIPs受體感知PIPs信號(hào)參與染色質(zhì)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在擬南芥中首次發(fā)現(xiàn)了 PHD類(lèi)蛋白，植物中該類(lèi)蛋白的功能研究尚少。大豆是我國(guó)五大作物之一，弄清其耐非生物脅迫分子機(jī)理，進(jìn)而為提高其耐逆性提供基礎(chǔ)，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的是提供一種大豆轉(zhuǎn)錄活性蛋白GmPHD6及其編碼基因與應(yīng)用。本專(zhuān)利技術(shù)所提供蛋白，名稱(chēng)為GmPHD6,來(lái)源于大豆屬大豆(Glycine max(L.)),是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中的序列2由248個(gè)氨基酸殘基組成。上述蛋白中，一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述蛋白GmPHD6的編碼基因GmPHD6也屬于本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍。該基因可為如下⑴或⑵或⑶的DNA分子:(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(I)限定的DNA序列雜交且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子;(3)與⑴限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為如下:50°C，在7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4和ImMEDTA的混合溶液中雜交，在50°C，2XSSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5MNaPOJP ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，I X SSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4 和 ImM EDTA 的混合溶液中雜交，在 50°C，0.5X SSC, 0.1% SDS 中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS、0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50°C，0.1 X SSC，0.1% SDS中漂洗；還可為:50°C，在7% SDS,0.5M NaPO4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65°C，0.1 XSSC,0.1% SDS中漂洗；也可為:在6XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1% SDS 和 1 X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。其中，序列表中的序列1由747個(gè)脫氧核苷酸組成，本序列為GmPHD6基因的讀碼框，編碼具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本專(zhuān)利技術(shù)基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍。上述重組載體具體為將蛋白GmPHD6的編碼基因插入pROK II載體的Xba I和KpnI識(shí)別位點(diǎn)間得到的重組載體；本專(zhuān)利技術(shù)還保護(hù)了擴(kuò)增上述蛋白GmPHD6的編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。上述引物對(duì)可為擴(kuò)增GmPHD6的所有引物對(duì)，具體可為如下(I)或(II):(I)由序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA組成的引物對(duì)；(II)由序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA組成的引物對(duì)。上述蛋白或其編碼基因或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育耐逆性植物中的應(yīng)用是本專(zhuān)利技術(shù)保護(hù)的范圍。上述應(yīng)用具體為將上述基因通過(guò)上述重組載體導(dǎo)入植物中，得到轉(zhuǎn)基因毛狀根；所述轉(zhuǎn)基因毛狀根的增長(zhǎng)率大于與轉(zhuǎn)空載體毛狀根，轉(zhuǎn)空載體毛狀根為將PROKII轉(zhuǎn)入植物得到的轉(zhuǎn)空載體毛狀根；在上述應(yīng)用中,所述耐逆性為耐旱性和/或耐鹽性；在上述應(yīng)用中，所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)施例中的雙子葉植物具體為大豆。所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。將所述基因?qū)肽康闹参?，?huì)使所述蛋白質(zhì)目的植物中合成，進(jìn)而是目的植物的耐逆性性狀得到改良。所述基因可先進(jìn)行如下修飾，再導(dǎo)入宿主中，以達(dá)到更好的表達(dá)效果:1)根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達(dá)；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛(ài)的密碼子，在保持本專(zhuān)利技術(shù)所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性；優(yōu)化過(guò)程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實(shí)現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達(dá)，其中GC含量可為35 %,優(yōu)選為多于45 %,更優(yōu)選為多于50%，最優(yōu)選多于約60% ；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進(jìn)行修飾；3)與各種植物表達(dá)的啟動(dòng)子連接，以利于其在植物中的表達(dá)；所述啟動(dòng)子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時(shí)序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動(dòng)子；啟動(dòng)子的選擇將隨著表達(dá)時(shí)間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達(dá)啟動(dòng)子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時(shí)期而定；盡管證明了來(lái)源于雙子葉植物的許多啟動(dòng)子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動(dòng)子用于雙子葉植物中的表達(dá)，單子葉植物的啟動(dòng)子用于單子葉植物中的表達(dá)；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本專(zhuān)利技術(shù)基因的表達(dá)效率；例如來(lái)源于CaMV的tml，來(lái)源于rbcS的E9 ;任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本專(zhuān)利技術(shù)基因進(jìn)行連接。5)引入增強(qiáng)子序列，如內(nèi)含子序列(例如來(lái)源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來(lái)源于TMV，MCMV和AMV)。在實(shí)際操作中，也可以將本專(zhuān)利技術(shù)基因進(jìn)行細(xì)胞靶向定位?？衫帽绢I(lǐng)域現(xiàn)有的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，將來(lái)源于靶向細(xì)胞器的靶基因序列與本專(zhuān)利技術(shù)基因序列融合，再導(dǎo)入植物細(xì)胞中，就可定位了。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。本專(zhuān)利技術(shù)的實(shí)驗(yàn)證明，GmPHD6的表達(dá)受高鹽本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

【技術(shù)特征摘要】

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳受宜，張勁松，韋偉，張玉芹，哈達(dá)，張萬(wàn)科，馬彪，林晴，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：北京;11