本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206，它是具有序列表中SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ?ID?NO：2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明專利技術(shù)還公開了上述小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206的編碼序列TaCRT1-681的應(yīng)用。通過基因工程的方法將本發(fā)明專利技術(shù)提供的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1-206轉(zhuǎn)入植物中，可以提高植物的耐鹽性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響植物的食品安全性，可廣泛應(yīng)用于各種植物的育種應(yīng)用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206及其編碼序列與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
土壤鹽潰化是一個世界性的資源問題和生態(tài)問題，高濃度的鹽將導(dǎo)致植物體內(nèi)離子紊亂，引起植物產(chǎn)量降低，死亡率升高，在全世界現(xiàn)有耕地中，至少有20%的灌溉土地都受到鹽脅迫的嚴(yán)重危害。為了適應(yīng)鹽脅迫，植物自身形成了一系列的調(diào)控機(jī)制:主要包括提高抗氧化酶系統(tǒng)的活性，消除自由基對植物機(jī)體的傷害，改變體內(nèi)各種激素含量，離子選擇性吸收，離子區(qū)域化，拒鹽作用、合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和ER (Endoplasmic Reticulum)相關(guān)的蛋白降解等。近期的研究逐漸把植物對鹽脅迫反應(yīng)與ER質(zhì)量檢測系統(tǒng)(EndoplasmicReticulum Quality Control, ERQC)聯(lián)系起來,在ERQC中包含一種特殊的UPS機(jī)制,稱為ER 相關(guān)的蛋白降解機(jī)制(ER Associated protein Degradation, ERAD), ERAD 特異性地降解ER中錯誤折疊的蛋白。小麥?zhǔn)鞘澜缟现匾募Z食作物之一，但土壤的鹽潰化往往導(dǎo)致其產(chǎn)量的下降。不同植物之間對鹽脅迫的適應(yīng)性機(jī)制存在相似性，因此，我們可以通過鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的應(yīng)用來提高植物的耐鹽性。鹽脅迫反應(yīng)的調(diào)控因子分為正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子。正調(diào)控因子的超量表達(dá)，可以提高植物的耐鹽性；而抑制該基因的表達(dá)則會導(dǎo)致耐鹽性的減弱。鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白(Calreticulin, CRT)是真核生物內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中一個重要的分子伴侶，不同生物體中的CRT蛋白序列存在較高的保守性，主要由N、P、C這三個保守的結(jié)構(gòu)域及信號肽與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)四肽滯留信號序列(HDEL或KDEL)構(gòu)成。目前，動物鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白已得到深入研究，結(jié)果表明CRT具有Ca2+的調(diào)控、細(xì)胞黏附、T-細(xì)胞的識別、基因的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種功能，尤其作為分子伴侶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中能幫助肽鏈的正確折疊裝配，防止錯誤折疊蛋白的積聚，有效去處錯誤蛋白對機(jī)體的脅迫作用。
技術(shù)實現(xiàn)思路
技術(shù)要求本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供一種小麥耐鹽鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206。本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問題是提供上述蛋白片段的編碼序列。本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因片段在培育耐鹽品種中的應(yīng)用。本專利技術(shù)是這樣實現(xiàn)的:一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206，它是具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白質(zhì)。所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列，它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:1所不的核昔酸序列； (2)編碼序列表中SEQID NO:2所示的氨基酸序列的多核苷酸； (3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID NO:1限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列是序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列含有681bp的核苷酸。含有上述TaCRTl-206蛋白片段的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也在本專利技術(shù)的保護(hù)范圍之內(nèi)，利用現(xiàn)有分子生物學(xué)的方法可以得到不同的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列在培育耐鹽品種中的應(yīng)用。利用任何一種可以引導(dǎo)外源基因在植物中超量表達(dá)的載體，將本專利技術(shù)所提供的TaCRTl-206蛋白片段編碼序列TaOTl-681導(dǎo)入植物細(xì)胞，可改變植物耐鹽性的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。使用載體時，其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行篩選，可以對載體進(jìn)行加工，如加入抗生素標(biāo)記基因(如潮霉素、卡那霉素和慶大霉素等)，加入抗生素標(biāo)記基因之后的載體用于轉(zhuǎn)化，可以在轉(zhuǎn)化后的植物培養(yǎng)基中加入抗生素，抑制非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和植株的生長，有助于快速和有效的獲得轉(zhuǎn)基因材料。為了便于觀察外源基因的表達(dá)，可以在載體中啟動子和外源基因之間或是外源基因與終止子之間加入報告基因(GUS基因、GFP和螢火蟲熒光素報告基因)，構(gòu)建外源基因和報告基因融合表達(dá)的載體，該載體用于遺傳轉(zhuǎn)化，可以觀察報告基因的表達(dá)與否和表達(dá)量高低，推測外源基因在植物體內(nèi)的表達(dá)情況。為了轉(zhuǎn)基因植物釋放的安全性，也可以在構(gòu)建載體時不攜帶任何篩選標(biāo)記基因或非抗生素篩選標(biāo)記基因，直接通過PCR鑒定或表型篩選鑒定。含有本專利技術(shù)的TaOTl-681片段的表達(dá)載體可通過使用基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、發(fā)粉管通道、電擊、顯微注射、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒或植物病毒等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成完整的植株。被轉(zhuǎn)化的植株既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，如:水稻、棉花、小麥、大豆、油菜、煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、白菜、蘿卜、楊樹、草坪草、苜蓿、藥材和花卉等。小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列可提高植物的耐鹽性。有益效果 通過基因工程的方法將本專利技術(shù)提供的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206轉(zhuǎn)入植物中，可以提聞植物的耐鹽性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內(nèi)源基因，因此，該基因的超量表達(dá)不會影響植物的食品安全性，可廣泛應(yīng)用于各種植物的育種應(yīng)用。附圖說明圖1轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性得到了提高。 圖2鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草與對照的根長比較。C89，野生型煙草；T-32，T-34，和Τ-36:轉(zhuǎn)基因煙草。圖3鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草與對照的根長。C89，野生型煙草；Τ-32，Τ-34，和Τ-36:轉(zhuǎn)基因煙草。圖4鹽脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草與對照的根重。C89，野生型煙草；Τ-32，Τ-34，和T-36:轉(zhuǎn)基因煙草。具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本專利技術(shù)。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本專利技術(shù)，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本專利技術(shù)。本專利技術(shù)的實施例1:小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的獲得。以小麥{Triticum aestivum L)品種望水白(Wangshuibai)(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用基因組室保存)為材料，在開花期將赤霉菌孢子液噴灑穗部，所用孢子液為江蘇省范圍內(nèi)強(qiáng)致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接種后立即套帶保濕，同時用水接種做為對照。接種6小時、12小時、24小時后分別取麥穗，立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、-20°C沉淀I小時；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷丙酮中，_20°C放置2小時；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，-20°C放置I小時，離心去丙酮，將沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10 μ L裂解液(7M脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA，0.3%蛋白酶抑制劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提15m本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRT1?206，其特征在于：它是具有序列表中SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ?ID?NO：2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ?ID?NO：2衍生的蛋白質(zhì)。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206，其特征在于:它是具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白，或者是將SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代、缺失或添加，且具有與SEQ ID NO:2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ IDNO:2衍生的蛋白質(zhì)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206，其特征在于:所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。3.—種如權(quán)利要求1所述的小麥鈣網(wǎng)聯(lián)蛋白片段TaCRTl-206的編碼序列，其特征在于:它是下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQID NO:I所不的核...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：向陽，杜才富，馬正強(qiáng)，韓宏仕，張敏琴，王麗群，宋敏，
申請(專利權(quán))人：貴州省油菜研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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