微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法技術

微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，涉及一種凝集素的分離純化方法。為了解決蕓豆凝集素分離純化倍率低、成本高、工藝多、時間長的問題，本發明專利技術提出的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過程和反萃取過程。本發明專利技術在微波輔助作用下，使蕓豆中水溶性蛋白迅速溶入水提液，大大提高了溶解度，縮短了浸提時間。本發明專利技術基于液-液萃取原理，提高了萃取的選擇性，可實現蕓豆凝集素的高效前萃取和反萃取。應用反膠束萃取技術只需前萃取和反萃取兩步即可達到較好的分離純化效果，步驟簡單，操作方便，與微波輔助集合可極大縮短前處理時間，節約成本。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種凝集素的分離純化方法，尤其涉及一種使用反膠束萃取技術直接從水提液中分離純化蕓豆凝集素的方法。
技術介紹
凝集素(lectin或agglutinin)是一類具有糖專一'丨生,可與細胞表面特殊糖蛋白、糖脂的寡糖結構結合，促使細胞凝集或糖復合物沉淀的，非免疫來源的糖蛋白或糖結合蛋白。凝集素用途廣泛，在生物化學研究中可用于含糖高分子的分離純化和糖鏈結構的鑒定；在生物學研究中可專一識別細胞表面信號分子，用于選擇突變細胞株、研究細胞機制和細胞表面特征及鑒定微生物；在免疫學研究中可促細胞有絲分裂，抑制腫瘤等惡性細胞的生長；在醫學上可鑒定血型，診斷病變和作為載體分子使藥物專一地靶向不同的細胞和組織。因此，凝集素在現代科研領域是一種重要的研究工具，凝集素的分離純化具有極為誘人的科研價值和市場前景。凝集素的研究始于1888年Herman Stillmark偶然發現蓖麻毒素(Ricicn)。至今已發現的凝集素以植物凝集素類為主，近1000種，廣泛分布于豆科、茄科、大戟科、禾木科、百合科和石蒜科等眾多的植物類群中，其中以豆科植物中的凝集素種類最為豐富，目前已有600余種。我國大部分地區具有蕓豆品種多、產量高的優勢，其豆中凝集素具有含量高、凝血效價高的特點，因此，蕓豆凝集素的分離和純化研究有著重要的現實意義。目前，凝集素的分離純化方法基本按照蛋白質的傳統分離方法進行，一般先將提取物經酸沉或鹽析，然后經陰離子和陽離子交換多次層析。在凝集素糖結合專一性已知的情況下，可利用親和層析法進行分離純化。程悅生等(1997)利用凝集素特殊的疏水結合位點，采用疏水相互作用色譜法分離得到大豆凝集素。200510011480.2通過不同飽和度的硫酸銨分級沉淀及多步的離子交換柱層析，得到一種黃芪凝集素蛋白。200610097429.2通過超聲強化酸提、鹽析、熱處理、超濾、親和層析等技術手段獲得麥胚凝集素。201110114904.3公開了一種純化大豆凝集素的親和層析填料D-GalN-FF-s印harose4B。201110025266.8用硫酸銨分級沉淀、超濾除鹽和濃縮、離子交換層析等方法純化得到一種蒜頭果仁凝集素。但是，以上方法還尚未擺脫凝集素分離純化過程中存在的操作繁瑣、處理量低、損耗大和耗時長(一般為I 3天)的不足之處。因此，建立快速、高效的凝集素分離純化技術勢在必行。近年來，反膠束萃取技術以其操作簡便、成本低、綠色、無污染、萃取率高、條件溫和、溶劑可反復使用和不易引起蛋白變性的優點而受到各國研究人員的廣泛關注。反膠束是特定表面活性劑分子在非表面活性劑體系中自發形成的納米級分子聚集體(lO-lOOnm)，一般為W/0形式。反膠束萃取技術通常包括前萃取和反萃取兩步過程。在前萃取過程中，蛋白質分子擴散到水相和有機相界面，通過控制萃取過程的有關工藝條件，在界面形成包容特定目標蛋白質分子的反膠束體系，含有蛋白質的反膠束在有機相中擴散而離開界面。在反萃取過程中，通過改變有關工 藝條件，含有蛋白質的反膠束在水相和有機相界面崩裂，特定目標蛋白從界面擴散到水溶液主體。候玉芳等(2010)和劉艷艷等(2011)以紅蕓豆細粉為原料，利用反膠束萃取技術在固-液狀態下提取植物凝集素。但固-液反膠束萃取具有分離純化倍率低(2 5倍)、特定蛋白選擇性差的局限性，而基于液-液反膠束技術萃取蕓豆凝集素的技術尚無系統性報道或專利，更無微波輔助的相關報道或專利。
技術實現思路
本專利技術目的在于克服現有技術的不足，解決蕓豆凝集素分離純化倍率低、成本高、工藝多、時間長的問題，提供一種高效率、易于操作、成本低且安全環保的。本專利技術提出的，為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過程和反萃取過程，如附圖說明圖1所示，具體步驟如下: (I)蕓豆凝集素水提液制備:所述蕓豆凝集素水提液為蕓豆磨粉，過40 100目篩，溶于5 50體積倍水溶液中，10 60°C下微波輔助浸提5 60min，功率為150 800W，浸提后經8000 15000rpm、4°C離心10 20min,取上清液； 所述蕓豆種類為紅蕓豆、紅花蕓豆、奶花蕓豆、黑蕓豆、白蕓豆和黃蕓豆等蕓豆品種；所述水溶液為蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，所述緩沖溶液濃度為10 50mM，所述水溶液pH值為6.0 8.0 ; 所述浸提微波輔助條件優選溫度25°C，功率325W，時間30min。(2)反膠束溶液配制:所述反膠束溶液 的組分包括表面活性劑、有機溶劑和水； 所述表面活性劑為陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑中的一種，優選方案為陰離子型表面活性劑或陽離子型表面活性劑，所述的陰離子型表面活性劑優選丁二酸-2-乙基己基磺酸鈉(Α0Τ)，所述的陽離子型表面活性劑優選溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴(CTAB)； 所述表面活性劑溶于有機溶劑的濃度為15 300mM ； 所述的水分添加量以調節W。值(反膠束含水率)在15 35為依據； 所述有機溶劑為η-烴類(C6 C1(I)、戊烷、環己烷、正己烷、辛烷、異辛烷、己醇和丁醇中的一種或兩種或多種，優選有機溶劑為異辛烷，優選助溶劑為己醇和丁醇的一種或兩種，優選助溶劑添加體積比為5 20 % ； 所述反膠束溶液的配制步驟為:按比例將表面活性劑加入到有機溶劑中，攪拌至表面活性劑完全溶解，加入一定的量的水，使體系W。值處于適宜范圍內，靜置所得透明溶液即為反膠束溶液。(3)前萃取過程:調節蕓豆凝集素水提液pH值和離子強度，將蕓豆凝集素水提液與所述反膠束溶液混合，搖床震蕩混合一定時間后，1500 5000rpm離心分層,取上層有機相； 所述蕓豆凝集素水提液PH值在陰離子型表面活性劑反膠束體系中為4.0 6.0，優選5.6 ;在陽離子型表面活性劑反膠束體系中為6.0 10.0，優選8.0 ； 所述蕓豆凝集素水提液離子強度為20 200mM，鹽離子類型優選NaCl，在陰離子型表面活性劑反膠束體系中優選80mM，在陰離子型表面活性劑反膠束體系中優選IOOmM ； 所述蕓豆凝集素水提液與反膠束溶液混合體積比為蕓豆凝集素水提液體積:反膠束溶液體積=1:1 1:50 ;所述混合時間為5 40min。(4)反萃取過程:將所述上層有機相與具有一定離子強度的反萃緩沖溶液混合，搖床震蕩混合一定時間后，1500 5000rpm離心分層，取下層水相，經除鹽、冷凍干燥，得到分離純化后的蕓豆凝集素。所述反萃緩沖溶液為在陰離子型表面活性劑反膠束體系中優選磷酸鹽緩沖溶液或TriS-HCl緩沖溶液，濃度為10 50mM，pH值為6.0 10.0 ;所述反萃緩沖溶液為在陽離子型表面活性劑反膠束體系中優選磷酸鹽-檸檬酸緩沖溶液，濃度為10 50mM，pH值為 3.5 5.5 ; 所述反萃緩沖溶液離子強度為100 IOOOmM,鹽離子類型優選KCl或KBr，優選500mM ；所述反萃取緩沖溶液助劑為乙醇、丙醇或丁醇，優選丁醇，優選反萃取緩沖溶液助劑添加體積比為O 10 % ； 所述上層有機相與反萃緩沖溶液混合體積比為上層水相:反萃緩沖溶液=1:1 1:50 ； 所述混合時間為5 40min。本專利技術蕓豆凝集素分離純化效率評價為:本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述方法為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過程和反萃取過程，具體步驟如下：（1）蕓豆凝集素水提液制備：蕓豆磨粉，過40～100目篩，溶于5～50體積倍水溶液中，10～60℃下微波輔助浸提5～60min，功率為150～800W，浸提后經8000～15000rpm、4℃離心10～20min，取上清液；（2）反膠束溶液配制：將表面活性劑加入到有機溶劑中，攪拌至表面活性劑完全溶解，加入一定的量的水，使體系Wo值處于15～35范圍內，靜置所得透明溶液即為反膠束溶液，其濃度為15～300mM；（3）前萃取過程：調節蕓豆凝集素水提液pH值為4.0～10.0，離子強度為20～200mM，將蕓豆凝集素水提液與反膠束溶液按照體積比為1:1～1:50的比例混合5～40min后，1500～5000rpm離心分層，取上層有機相；（4）反萃取過程：將上述上層有機相與具有一定離子強度的反萃緩沖溶液按照體積比為1:1～1:50的比例混合5～40min后，1500～5000rpm離心分層，取下層水相，經除鹽、冷凍干燥，得到分離純化后的蕓豆凝集素。

【技術特征摘要】
1.一種微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述方法為直接從蕓豆凝集素水提液中分離純化凝集素，包括前萃取過程和反萃取過程，具體步驟如下: (1)蕓豆凝集素水提液制備:蕓豆磨粉，過40 100目篩，溶于5 50體積倍水溶液中，10 60°C下微波輔助浸提5 60min，功率為150 800W，浸提后經8000 15000rpm、4°C離心10 20min,取上清液； (2)反膠束溶液配制:將表面活性劑加入到有機溶劑中，攪拌至表面活性劑完全溶解，加入一定的量的水，使體系W。值處于15 35范圍內，靜置所得透明溶液即為反膠束溶液，其濃度為15 300mM ； (3)前萃取過程:調節蕓豆凝集素水提液pH值為4.0 10.0，離子強度為20 200mM，將蕓豆凝集素水提液與反膠束溶液按照體積比為1:1 1:50的比例混合5 40min后，1500 5000rpm離心分層，取上層有機相； (4)反萃取過程:將上述上層有機相與具有一定離子強度的反萃緩沖溶液按照體積比為1:1 1:50的比例混合5 40min后，1500 5000rpm離心分層,取下層水相,經除鹽、冷凍干燥，得到分離純化后的蕓豆凝集素。2.根據權利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述蕓豆種類為紅蕓豆、紅花蕓豆、奶花蕓豆、黑蕓豆、白蕓豆或黃蕓豆。3.根據權利要求1所述的微波輔助反膠束分離純化蕓豆凝集素的方法，其特征在于所述水溶液為蒸餾水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液，水溶液pH值為6.0 8.0，緩沖溶液...

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬鶯，何述棟，李琳，何勝華，王超，
申請(專利權)人：哈爾濱工業大學，
類型：發明
國別省市：