一種半夏凝集素蛋白的提取方法技術

本發明專利技術公開了一種半夏凝集素蛋白的提取方法，將絞碎的宿半夏塊莖加入到半夏蛋白提取劑中，4℃左右的低溫下高速離心，所得去雜后的半夏總蛋白加入飽和度為20%-90%的硫酸銨溶液中去，充分的混勻沉淀后，將其置于低溫高速離心機中6000rad·min-1左右離心20min左右，后將得到的蛋白質溶液超濾，透析，過葡聚糖凝膠柱，分離純化得到半夏凝集素蛋白，冷凍真空干燥得半夏凝集素蛋白粉末。本發明專利技術經過大量的實驗研究，獲得了高效提取半夏蛋白的工藝技術，應用于制造環保的安全的價格低廉的半夏蛋白添加產品。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及分離純化半夏蛋白
，確切地說是。
技術介紹
半夏為天南星科植物,半夏ternata (Thunb. ) Breit.的塊莖是一種重要的中藥材。植物半夏為廣布物種，在我國大部分地區及朝鮮半島和日本均有分布，以長江流域為最多。半夏入藥首載于《神農本草經》，1990年版的《中國藥典》收載為唯一的半夏類藥材植物。據統計，在558種中藥處方中，半夏使用頻率居第22位。半夏主要含有淀粉(占 75%左右)、半夏蛋白、生物堿、β_谷留醇、多糖、氨基酸、揮發油及無機元素等多種化學成分。其藥理作用有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結；外用可治急性乳腺炎、急慢性化膿中耳炎等。近年來研究發現，半夏還具有抗腫瘤、抗生育、降血脂、護肝和治療冠心病等多種重要作用。半夏的化學成分有半夏蛋白、生物堿、半夏淀粉、留醇類、氨基酸、揮發油、芳香族成分、 有機酸類、黃酮類、鞣質以及多種微量元素等，其中，半夏蛋白是半夏的主要藥效成分之一。 其藥理作用有潤燥化痰，降逆止嘔，消痞散節等功效。近年來研究發現，半夏還具有抗腫瘤、 抗生育、降血脂、護肝和治療冠心病等多種重要作用。半夏凝集素蛋白ipinellin)是一種從半夏屬塊莖中分離純化出來的植物蛋白， 它是一種植物凝集素，能與甘露糖專一性結合，具有凝血、抗腫瘤、抗生育、殺蟲等重要的藥理作用，以及半夏蛋白的基因工程已成為近年來研究的熱點。半夏蛋白在半夏眾多的化學成分中具有明顯的生物活性，是半夏抗腫瘤和抗生育等藥理作用的主要有效成分。現今已經報道了多種半夏凝集素蛋白的提取方法，但提取率較低。以前研究的半夏蛋白提取劑主要是稀鹽緩沖液，還有丙酮等有機溶劑。由于稀鹽緩沖液提取半夏蛋白的得率不高；同時有機溶劑提取法有毒，且通過此法提取的半夏凝集素蛋白易失去活性，對以后進 一步應用帶來困難。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種半夏凝集素蛋白的提取工藝，利用該方法可以獲得純度較高的、濃度較大的專一性的半夏凝集素蛋白，節省材料，提高提取效率。上述目的通過以下方案實現，其特征在于包括以下步驟(O稱取一定量的宿半夏塊莖，洗凈并將其絞碎；(2)將絞碎的宿半夏塊莖加入到半夏蛋白提取劑中，4°C左右的低溫下高速離心，得去雜后的半夏總蛋白溶液，所述的半夏蛋白提取劑是由下述重量百分比的原料混勻而得 氯化鈉O. 05-5. 0，甲酸O. 10- 5. 0，水余量；(3)將步驟(2)所得去雜后的半夏總蛋白加入飽和度為20-90%的硫酸銨溶液中去，充分的混勻沉淀后，將其置于低溫高速離心機中6000 rad · mirT1左右離心20min左右，后將得到的蛋白質溶液超濾；(4)再將超濾后的蛋白質溶液透析；(5)將透析過的蛋白質溶液過葡聚糖凝膠柱，分離純化得到半夏凝集素蛋白，冷凍真空干燥得半夏凝集素蛋白粉末。所述的，其特征在于所述的半夏塊莖泥與半夏蛋白提取劑的料液比為1:12-18。所述的，其特征在于所述的硫酸銨溶液的飽和度為 50-70%ο所述的，其特征在于所述的半夏蛋白提取劑的 pH 為 0-5，料液比為 1/10-1/50。所述的，其特征在于所述的葡聚糖凝膠柱的規格為 G10-G200。本專利技術的創新點在于專利技術了一種新的半夏凝集素蛋白提取劑，應用于高濃度的半夏凝集素蛋白提取，節省材料，增加提取效率。本專利技術是經過大量的實驗研究，確定影響半夏凝集素蛋白提取的幾種因素，如蛋白質提取液的選擇、料液比的配比、提取條件的設定，以及后續的半夏凝集素蛋白的分離純化方法的選擇。本專利技術采用正交試驗設計，提高了半夏凝集素蛋白的提取率，通過大量的實驗確定其最佳提取工藝參數。本專利技術所述的產物是半夏總蛋白和專一性的半夏凝集素蛋白，最終是經過冷凍真空干燥獲得的半夏凝集素蛋白粉末。本專利技術所述的半夏凝集素蛋白最終是應用于制成半夏植物源農藥，或者是添加到含有半夏藥用成分的半夏藥劑中。本專利技術所述的是以宿半夏為原材料制備純度較高的、濃度較大的半夏凝集素蛋白的方法。主要步驟分為第一步利用半夏塊莖材料高效獲得半夏總蛋白。第二步將半夏總蛋白分離純化得到專一性的半夏凝集素蛋白。 獲得了一種新型的且能夠高效提取半夏蛋白的提取劑，此種提取劑主要是將不同濃度的氯化鈉以及不同濃度的甲酸進行配比組合而成，這種提取劑能大大提高半夏凝集素蛋白的得率，且操作步驟簡單快捷。同時，在后續的半夏蛋白純化過程中，我們采用的是將半夏總蛋白液過葡聚糖凝膠層析柱，此法得到的半夏蛋白純度高。以上這種新型的蛋白質提取工藝解決了半夏蛋白提取困難，提取率低等問題。具體的說是先將半夏塊莖粉碎，再使用氯化鈉甲酸提取劑提取半夏蛋白，后通過超濾、過凝膠柱分離純化半夏總蛋白，獲得純度較高的、濃度較大的專一性的半夏凝集素蛋白，再經真空干燥得到其成品。本專利技術研究確定了一種可以高效提取半夏凝集素蛋白的提取劑，通過設計正交試驗L9 (34)對氯化鈉濃度、甲酸濃度、料液比三個因素進行了篩選和優化，探討半夏凝集素蛋白提取最優條件和最佳提取時期。確定了最佳的提取劑最佳配比組合(氯化鈉為O. 05-5. 0， 甲酸為O. 10- 5. 0，水補充至100 ；pH為0-5。料液比為1/10-1/50)。具體實施方式實施例1主要步驟如下a).取2000g新鮮的洗凈的半夏塊莖，用高速組織粉碎機將其粉碎成泥狀。b).配制半夏總蛋白提取液氯化鈉為160 g，甲酸為120 mL，水補充至40 L。 c).將半夏塊莖粉碎物添加到半夏提取劑中，不斷地攪拌使其混合均勻。d).將上述材料，放入低溫冷凍12h 36h，后將其溶解使半夏細胞膜破裂，內含物都溶解出來。e).解凍后，攪拌均勻，離心去雜質，剩上清液。f).用飽和度為20% 90%的硫酸銨沉淀半夏蛋白，不同飽和度的蛋白沉淀分開收集儲存。g).將不同飽和度的硫酸銨蛋白質沉淀物，通過超濾(超濾膜透過分子量為 1000 10000)將雜質分子去除，得到純蛋白質溶液。h).利用分光光度計在波長為280nm和260nm測量吸光值，根據公式測提取液中半夏蛋白的含量，總蛋白得率為2. 86%。i).將純半夏蛋白溶液過葡聚糖凝膠柱(G10-G200)，進行分離層析，得到專一性的半夏凝集素蛋白液。j).將得到的半夏凝集素蛋白液冷凍真空干燥，得到其粉末。專一性的半夏凝集素蛋白得率為O. 346%。實施例2 :主要步驟如下a).取2000g新鮮的洗凈的半夏塊莖，用高速組織粉碎機將其粉碎成泥狀。 b).提取液氯化鈉為120g，甲酸為90 mL，水補充至20 L。c).加入5 L的丙酮(含O. 07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4°C,8000 rad mirT1 離心)，備用，超濾后測其總蛋白得率為1. 74%。e).后過葡聚糖凝膠柱(G10-G200)，得到純半夏凝集素蛋白液。f).將得到的半夏凝集素蛋白液真空干燥，得到其粉末。專一性的半夏凝集素蛋白得率為O. 223%。實施例3 :主要步驟如下a).稱取2000 g新鮮的半夏塊莖，清水洗凈后用濾紙將水吸干。用高速組織粉碎機將其粉碎成泥狀。b).將粉碎的半夏轉置干凈燒杯中，提取液為氯化鈉為200 g，甲酸為140 mL，水補充至30 L0c).水浴攪拌抽提，再用布氏漏斗過濾。d).取濾液5000 r · mirT1離心30min,得上清液。e).上清液采本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種半夏凝集素蛋白的提取方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）?稱取一定量的宿半夏塊莖，洗凈并將其絞碎；（2）?將絞碎的宿半夏塊莖加入到半夏蛋白提取劑中，?4℃左右的低溫下高速離心，得去雜后的半夏總蛋白溶液，所述的半夏蛋白提取劑是由下述重量份的原料混勻而得：氯化鈉0.05?5.0，甲酸0.10??5.0，水補充至100；（3）將步驟（2）所得去雜后的半夏總蛋白加入飽和度為20?90%的硫酸銨溶液中去，充分的混勻沉淀后，將其置于低溫高速離心機中6000?rad·min?1?左右離心20min左右，后將得到的蛋白質溶液超濾；（4）再將超濾后的蛋白質溶液透析；（5）將透析過的蛋白質溶液過葡聚糖凝膠柱，分離純化得到半夏凝集素蛋白，冷凍真空干燥得半夏凝集素蛋白粉末。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：薛建平，杜圣艷，趙偉，盛瑋，李進步，歷雪英，
申請(專利權)人：安徽省淮北市農藥廠，
類型：發明
國別省市：