本發(fā)明專利技術公開了一種煙草JAZ蛋白基因及其應用。所述基因命名為NtJAZ3.2，該基因編碼的蛋白具有典型的TIFY結(jié)構域和jas結(jié)構域，且受茉莉素的誘導表達。通過構建NtJAZ3.2基因的RNAi轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化煙草，成功抑制了NtJAZ3.2在煙草細胞中的表達，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草細胞系的尼古丁含量較野生型明顯降低。本發(fā)明專利技術為獲得低尼古丁含量煙草育種提供了重要的科學依據(jù)和技術支撐。
【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及煙草尼古丁的合成及調(diào)控相關基因，特別涉及調(diào)控煙草尼古丁合成的基因在降低煙草尼古丁含量方面的應用。
技術介紹
吸煙嚴重危害人的身體健康，因而如何減少吸煙的危害已成為各國政府、醫(yī)學專家、植物學家傾力關注、研究的課題之一。許多世界頂級煙草公司投入巨資對煙草次生代謝物的代謝途徑、調(diào)控機制進行研究。尼古丁是一種吡啶類生物堿，主要存在于茄科煙草屬 (Nicotiana)植物中，是煙草體內(nèi)的一種重要的次生代謝產(chǎn)物。目前對尼古丁生物合成的研究主要集中在克隆其代謝相關的酶并分析其生理和生化特性方面。尼古丁是在植物的根部形成并經(jīng)過木質(zhì)部轉(zhuǎn)運到葉片沉積下來。尼古丁合成的前體是基本的氨基酸精氨酸和鳥氨酸以及天門冬氨酸。它們經(jīng)一系列的代謝合成途徑中的關鍵酶PMT，QPT和MPO等催化最終生成尼古丁(Chintapakorn and Hamill, 2003. Antisense-mediated down-r e gu I at i on of putrescineN-methyItransferase activity in transgenic Nicotiana tabacum L ca n lead to elevated levels ofanatabine at the expense of nicotine. Plant Molecular Biology 53:87-105.) 尼古丁生物合成受多種因素的調(diào)控，發(fā)育調(diào)控的激素信號就是很重要的一類。茉莉素(JAs)是茉莉酸及其衍生物的統(tǒng)稱，是植物體內(nèi)起全局調(diào)控作用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)， 廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中。并且在植物受到生物脅迫和非生物脅迫時，JAs還能改變細胞內(nèi)基因表達和介導植物的防御反應。研究證明尼古丁代謝途徑上的關鍵酶，如MPT，QPT和MPO均受植物傷誘導激素-茉莉素的誘導而表達，從而形成尼古丁。自1962年發(fā)現(xiàn)茉莉酸至今，人們對茉莉酸的合成途徑已經(jīng)非常了解，但對茉莉素的信號傳導途徑及其調(diào)控植物的生長發(fā)育和應激反應的分子機制并不清楚。2007年三個課題組相繼報道在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一類新的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)子，被命名為榮莉素ZIM結(jié)構域蛋白家族(簡稱JAZ蛋白)。它通過抑制榮莉素響應基因的表達而發(fā)揮其生理功倉泛(Chini et al. , 2007. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature 448:U664-U664;Thines et al. , 2007. JAZ repressor proteins are targets of the SCFCOllcomplex during jasmonate signalling. Nature 448:U661-U662. ;Yan et al.,2007. A DownstreamMediator in the Growth Repression Limb of the Jasmonate Pathway. Plant Cell 19，2470-2483.)。當沒有茉莉素時，JAZ 蛋白的C-端結(jié)合在MYC2轉(zhuǎn)錄因子的N-端，抑制茉莉素誘導基因的表達；當植物體內(nèi)有茉莉素存在時，JAZ蛋白同SCFam復合物相互作用，從而導致JAZ蛋白的聚泛素化而被26S蛋白酶體降解，釋放出MYC2轉(zhuǎn)錄因子激活茉莉素誘導基因的表達。研究尼古丁的代謝調(diào)控是非常有意義的一項工作。尼古丁對人體有很強的生理刺激作用，是煙草商業(yè)性使用的物質(zhì)基礎。對煙草而言，尼古丁是一種抵御昆蟲侵害的防御性物質(zhì)。在沒有受到傷害的煙草植株中，尼古丁含量大約為0.1%-1.0%。受到植食性昆蟲侵害或機械損傷后，煙草植株內(nèi)茉莉素含量可以增加到原來的9倍(Ziegler et al.,2001. Herbivore-1nducedallene oxide synthase transcripts and jasmonic acid in Nicotiana attenuata. Phytochemistry 58:729-738.),而尼古丁含量可以達到 4-10倍 (Baldwin, 1998. Jasmonate-1nduced responses arecostly but benefit plants under attack in native populations. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America 95,8113-8118.)，這個濃度會使大多數(shù)食葉性昆蟲立即死亡，從而保護受害蟲侵害的組織，達到抗蟲的目的。實驗結(jié)果證明茉莉素可以調(diào)控尼古丁的生成，但是其分子機制并不清楚。目前，對于JAZ蛋白的研究，在擬南芥中一共發(fā)現(xiàn)12個成員，這不難使我們思考， 煙草中有沒有這樣的JAZ蛋白，以及這些蛋白是否參與了茉莉素誘導的煙草尼古丁的合成。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的在于尋找與煙草尼古丁含量相關的功能基因，進而提供一種降低煙草尼古丁含量的方法，為低尼古丁含量煙草育種提供技術手段。本專利技術的研究發(fā)現(xiàn)，煙草中的某些NtJAZs是受茉莉 素的誘導而表達。通過RNAi 技術在煙草中干擾其各自的表達，獲得轉(zhuǎn)基因細胞系，檢測發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因細胞系中尼古丁的含量相對野生型要低很多。由此推測，利用轉(zhuǎn)基因技術，干擾、沉默或敲除某些NtJAZs， 可為獲得低尼古丁含量煙草育種提供重要的科學依據(jù)。鑒于該類基因的應用價值及其利用潛力的應用前景，有必要通過專利加以保護。本專利技術提供的用于降低煙草尼古丁含量的基因?qū)儆贘AZ家族蛋白基因，來源于煙草(Nicotiana tabacum),命名為NtJAZ3. 2,編碼下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)⑴序列表中的SEQ ID No 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQ ID No :1所示氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、 缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。序列表中的SEQ ID No 1序列由200個氨基酸殘基組成，其中第86位至第91位氨基酸殘基是TIFY結(jié)構域，第151位至第169位氨基酸殘基是jas結(jié)構域。所述取代、缺失或添加的一至十個氨基酸殘基可以是非上述結(jié)構域中的氨基酸殘基，其改變不會對該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對氨基酸殘基進行取代、缺失或添加，以及對相關功能的檢測可以通過本領域的常規(guī)技術來實現(xiàn)。本專利技術的煙草JAZ蛋白基因NtJAZ3. 2可以是其cDNA序列，也可以是基因組DNA 序列，或者是與這些序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQID NO 2所示的DNA序列。通過對煙草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行de novo拼接，利用所獲得的煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及NCBI公布的煙草基因組序列片段和EST片段進行擬南芥同源JAZ的Blast分析，本專利技術的相關研究獲得了一系列煙草JAZ蛋白(NtJAZs)成員。其中，設計引物克隆了 NtJAZ3. 2 的ORF全長序列(SEQ ID NO本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
一種煙草JAZ蛋白，是下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)：(i)序列表中的SEQ?ID?No：1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQ?ID?No：1所示氨基酸序列經(jīng)過一至十個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：韓生成，王英典，趙和平，楊玉萍，
申請(專利權)人：北京師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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