本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種煙草JAZ蛋白基因及其降低煙草尼古丁含量的應(yīng)用。所述基因是一種煙草JAZ蛋白基因，命名為NtJAZ7，該基因編碼的蛋白具有典型的TIFY結(jié)構(gòu)域和jas結(jié)構(gòu)域，且受茉莉素的誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建NtJAZ7基因的RNAi轉(zhuǎn)基因載體并轉(zhuǎn)化煙草，成功抑制了NtJAZ7在煙草細(xì)胞中的表達(dá)，所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞系的尼古丁含量較野生型明顯降低。本發(fā)明專利技術(shù)為獲得低尼古丁含量煙草育種提供了重要的科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及煙草尼古丁的合成及調(diào)控相關(guān)基因，特別涉及調(diào)控?zé)煵菽峁哦『铣傻幕蛟诮档蜔煵菽峁哦『糠矫娴膽?yīng)用。
技術(shù)介紹
吸煙嚴(yán)重危害人的身體健康，因而如何減少吸煙的危害已成為各國(guó)政府、醫(yī)學(xué)專 家、植物學(xué)家傾力關(guān)注、研究的課題之一。許多世界頂級(jí)煙草公司投入巨資對(duì)煙草次生代謝物的代謝途徑、調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。尼古丁是一種吡啶類生物堿，主要存在于茄科煙草屬(Nicotiana)植物中，是煙草體內(nèi)的一種重要的次生代謝產(chǎn)物。目前對(duì)尼古丁生物合成的研究主要集中在克隆其代謝相關(guān)的酶并分析其生理和生化特性方面。尼古丁是在植物的根部形成并經(jīng)過(guò)木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片沉積下來(lái)。尼古丁合成的前體是基本的氨基酸精氨酸和鳥(niǎo)氨酸以及天門(mén)冬氨酸。它們經(jīng)一系列的代謝合成途徑中的關(guān)鍵酶PMT，QPT和MPO等催化最終生成尼古丁(Chintapakorn and Hamill, 2003. Antisense-mediated down-regulationof putrescineN-methyItransferase activity in transgenic Nicotiana tabacum L canlead to elevated levels ofanatabine at the expense of nicotine. Plant MolecularBiology 53:87-105. )D尼古丁生物合成受多種因素的調(diào)控，發(fā)育調(diào)控的激素信號(hào)就是很重要的一類。茉莉素(JAs)是茉莉酸及其衍生物的統(tǒng)稱，是植物體內(nèi)起全局調(diào)控作用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛分布于植物的幼嫩組織、花和發(fā)育的生殖器官中。并且在植物受到生物脅迫和非生物脅迫時(shí)，JAs還能改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)和介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。研究證明尼古丁代謝途徑上的關(guān)鍵酶，如MPT，QPT和MPO均受植物傷誘導(dǎo)激素-茉莉素的誘導(dǎo)而表達(dá)，從而形成尼古丁。自1962年發(fā)現(xiàn)茉莉酸至今，人們對(duì)茉莉酸的合成途徑已經(jīng)非常了解，但對(duì)茉莉素的信號(hào)傳導(dǎo)途徑及其調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制并不清楚。2007年三個(gè)課題組相繼報(bào)道在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一類新的轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)節(jié)子，被命名為榮莉素ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族(簡(jiǎn)稱JAZ蛋白)。它通過(guò)抑制榮莉素響應(yīng)基因的表達(dá)而發(fā)揮其生理功倉(cāng)泛(Chini et al. , 2007. The JAZ family of repressors is the missing linkin jasmonate signalling. Nature 448:U664-U664;Thines et al. , 2007. JAZ repressorproteins are targets of the SCFCOllcomplex during jasmonate signalling. Nature448:U661-U662. ;Yan et al.,2007. A DownstreamMediator in the Growth RepressionLimb of the Jasmonate Pathway. Plant Cell 19，2470-2483.)。當(dāng)沒(méi)有茉莉素時(shí)，JAZ 蛋白的C-端結(jié)合在MYC2轉(zhuǎn)錄因子的N-端，抑制茉莉素誘導(dǎo)基因的表達(dá)；當(dāng)植物體內(nèi)有茉莉素存在時(shí)，JAZ蛋白同SCFam復(fù)合物相互作用，從而導(dǎo)致JAZ蛋白的聚泛素化而被26S蛋白酶體降解，釋放出MYC2轉(zhuǎn)錄因子激活茉莉素誘導(dǎo)基因的表達(dá)。研究尼古丁的代謝調(diào)控是非常有意義的一項(xiàng)工作。尼古丁對(duì)人體有很強(qiáng)的生理刺激作用，是煙草商業(yè)性使用的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)煙草而言，尼古丁是一種抵御昆蟲(chóng)侵害的防御性物質(zhì)。在沒(méi)有受到傷害的煙草植株中，尼古丁含量大約為0.1%-1.0%。受到植食性昆蟲(chóng)侵害或機(jī)械損傷后，煙草植株內(nèi)茉莉素含量可以增加到原來(lái)的9倍(Ziegler etal.,2001. Herbivore-1nducedallene oxide synthase transcripts and jasmonic acidin Nicotiana attenuata. Phytochemistry 58:729-738.),而尼古丁含量可以達(dá)到 4-10倍(Baldwin, 1998. Jasmonate-1nduced responses arecostly but benefit plants underattack in native populations. Proceedings of the National Academyof Sciences ofthe United States of America 95,8113-8118.)，這個(gè)濃度會(huì)使大多數(shù)食葉性昆蟲(chóng)立即死亡，從而保護(hù)受害蟲(chóng)侵害的組織，達(dá)到抗蟲(chóng)的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明茉莉素可以調(diào)控尼古丁的生成，但是其分子機(jī)制并不清楚。目前，對(duì)于JAZ蛋白的研究，在擬南芥中一共發(fā)現(xiàn)12個(gè)成員，這不難使我們思考，煙草中有沒(méi)有這樣的JAZ蛋白，以及這些蛋白是否參與了茉莉素誘導(dǎo)的煙草尼古丁的合成。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于尋找與煙草尼古丁含量相關(guān)的功能基因，進(jìn)而提供一種降低煙草尼古丁含量的方法，為低尼古丁含量煙草育種提供技術(shù)手段。本專利技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，煙草中的某些NtJAZs是受茉莉素的誘導(dǎo)而表達(dá)。通過(guò)RNAi技術(shù)在煙草中干擾其各自的表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中尼古丁的含量相對(duì)野生型要低很多。由此推測(cè)，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，干擾、沉默或敲除某些NtJAZs，可為獲得低尼古丁含量煙草育種提供重要的科學(xué)依據(jù)。鑒于該類基因的應(yīng)用價(jià)值及其利用潛力的應(yīng)用前景，有必要通過(guò)專利加以保護(hù)。本專利技術(shù)提供的用于降低煙草尼古丁含量的基因?qū)儆贘AZ家族蛋白基因，來(lái)源于煙草(Nicotiana tabacum),命名為NtJAZ7,編碼下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)⑴序列表中的SEQ ID No 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQ ID No :1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。序列表中的SEQ ID No 1序列由350個(gè)氨基酸殘基組成，其中第159位至第164位氨基酸殘基是TIFY結(jié)構(gòu)域，第294位至第312位氨基酸殘基是jas結(jié)構(gòu)域。所述取代、缺失或添加的一至十個(gè)氨基酸殘基可以是非上述結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影響。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加，以及對(duì)相關(guān)功能的檢測(cè)可以通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本專利技術(shù)的煙草JAZ蛋白基因NtJAZ7可以是其cDNA序列，也可以是基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90 %以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。例如序列表中SEQID NO 2所示的DNA序列。通過(guò)對(duì)煙草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行de novo拼接，利用所獲得的煙草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及NCBI公布的煙草基因組序列片段和EST片段進(jìn)行擬南芥同源JAZ的Blast分析，本專利技術(shù)的相關(guān)研究獲得了一系列煙草JAZ蛋白(NtJAZs)成員。其中，設(shè)計(jì)引物克隆了 NtJAZ7的ORF全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO :2)，其編碼的蛋白序列如序列表中的SEQ ID No:l所本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種煙草JAZ蛋白，是下述蛋白質(zhì)(i)或(ii)：(i)序列表中的SEQ?ID?No：1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(ii)序列表中的SEQ?ID?No：1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與(i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：韓生成，王英典，趙和平，楊玉萍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：北京師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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