本發明專利技術涉及生物醫藥工程技術領域，具體涉及一種缺失疏水區的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列及其應用。本發明專利技術提供的一種人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體，是缺失疏水區的Tat△(31-45)突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本發明專利技術還提供了該Tat蛋白突變體在制備HIV免疫原、預防和治療性HIV疫苗、HIV檢測試劑盒中的應用，本發明專利技術的Tat△(31-45)突變體蛋白及其金標體顆粒均有助于該蛋白構象的穩定、免疫原性的增強以及該蛋白N端和第46-61位氨基酸表位的展示，有望作為HIV疫苗開發和HIV感染檢測診斷的候選抗原。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥工程
，具體涉及一種缺失疏水區的人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) Tat蛋白突變體序列，及其在制備HIV免疫原中、在制備預防和治療性HIV疫苗中、在制備HIV檢測試劑盒中的應用。
技術介紹
人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)主要經血液、性接觸及母嬰垂直途徑等傳播，可引起獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，即艾滋病。據聯合國艾滋病規劃署2012年的統計，全球HIV感染者約3400萬，我國現存HIV感染者和艾滋病病人約38萬，艾滋病已經成為我國及全球所面臨的重大公共衛生問題。目前采用高效抗逆轉錄病毒療法(HAART)雖能延緩艾滋病病情的發展，但不能完全清除病毒；行為干預也僅減緩HIV感染傳播速度而無法終止其流行。因此，迫切需要開發研制新的有效的藥物以控制HIV的傳播和感染。感染人類的HIV有HIV-1和HIV-2兩型，兩者核苷酸序列相差可超過40%。世界各地主要流行的是HIV-1，HIV-2則主要流行在非洲西部地區。HIV-1 轉錄反式激活因子(trans-activator of transcription, Tat)是 HIV-1感染早期產生的重要調控蛋白。根據HIV-1毒株的不同，Tat蛋白由86-101個氨基酸殘基組成，由兩個獨立的外顯子編碼:第I個外顯子編碼1-72位氨基酸(aa)，具有完全的轉錄激活活性 ’第2外顯子編碼Tat C末端區(73-101aa)。試驗證實Tat在HIV-1復制、擴散及致病中起重要作用。研究表明，在感染細胞內，Tat可反式激活HIV基因組轉錄的起始和延長，從而啟動和促進病毒的復制；而分泌和釋放至細胞外的Tat還具有多樣的胞外活性，如參與免疫抑制、神經系統損傷 及Kaposi肉瘤形成等致病過程，被稱為“病毒毒素”(參見文獻:Silvers JM, Aksenova MV, Aksenov MY, Mactutus CF, Booze RM.NeurotoxicityofHIV-1Tat protein:1nvolvement of Dldopamine receptor.Neurotoxicology.2007;28(6):1184-1190.)。Tat上述生物學特性及致病效應已使其成為HIV預防性及治療性疫苗的候選抗原之一。HIV-1Tat分子為天然非折疊蛋白，屬于無規卷曲類型的分子。雖然Tat序列在HIV-1不同亞型間具有高度保守性，但其缺乏穩定二級結構和高級結構，使其分子構象極不穩定，處于快速動態的變化之中。天然Tat作為HIV疫苗的候選抗原尚存在誘發免疫保護性抗體滴度低、交叉反應性差等不足。因此通過分子生物學手段，對HIV-1天然Tat分子結構進行改造，是獲得分子構象相對穩定的新型Tat免疫原的一條有效途徑，具有潛在的HIV疫苗開發價值。本申請人已于2011年3月25日申請了中國專利技術專利，涉及三種人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列:Tat突變體抗原I (Tatl-37)由37個氨基酸組成；Tat突變體抗原2 (Tatl-61)由61個氨基酸組成；Tat突變體抗原3 (Tat22-101)由80個氨基酸組成(參見中國專利申請CN201110074185.7，專利技術名稱為“人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列及其應用”，申請公布號為CN102206255A，申請公布日為2011年10月5日)。
技術實現思路
本專利技術的目的在于進一步深入地對HIV-1天然Tat分子結構進行改造，尋找分子構象穩定的新的Tat蛋白突變體序列，并提供該Tat蛋白突變體序列在制備HIV免疫原中、在制備預防和治療性HIV疫苗中、在制備HIV檢測試劑盒中的應用。本申請人通過對Tat蛋白進行疏水性分析發現，Tat第31-45位氨基酸具有較強的疏水性，其余部分均有較強的親水性(圖1)。鑒于Tat31-45肽段的疏水性對于Tat蛋白的表達有較大的影響，申請人設想通過分子生物學手段，對HIV-1天然Tat分子結構進行改造，截去Tat蛋白中疏水區段，有望提高Tat蛋白的表達量并獲得分子構象相對穩定的新型Tat免疫原，具有潛在的HIV疫苗開發和HIV感染檢測診斷價值。本專利技術的第一方面，是提供了一種缺失疏水區的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列(以下也稱Tat Λ (31-45)或Tat Λ (31-45)突變體或Tat Λ (31-45)序列):Tat Δ (31-45)突變體由86個氨基酸組成，其氨基酸序列為:H2N-MEPVDPRLEPWKHPG SQPKTACTNCYCKKCSYGRKKRRQRRRAHQNSQTHQASLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPVD— COOH (SEQ ID NO:1);編碼Tat Δ (31-45)突變體的核苷酸序列為:5 ' -ATGGAACCGGTTGACCCGCGTCTGGAACCGTGGAAACACCCGGGTTCTCAGCCGAAAACCGCTTGCACCAACTGCTACTGCAAAAAATGCTCTTACGGTCGTAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGCTCACCAGAACTCTCAGACCCACCAGGCTTCTCTGTCTAAACAGCCGGCTTCTCAGCCGCGTGGTGACCCGACCGGTCCGAAAGAATCTAAAAAAAAAGTTGAACGTGAAACCGAAACCGACCCGGTTGAC-3/ (SEQ ID NO:2)。本專利技術的第二方面，是提供了上述缺失疏水區的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列及其編碼基因在制備HIV免疫原中的應用。進一步地，本專利技術還提供了上述一種缺失疏水區的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列及其編碼基因在制備預防和治療性HIV疫苗中的應用。進一步地，本專利技術還提供了上述一種缺失疏水區的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體序列及其編碼基因在制備HIV檢測試劑盒中的應用。本專利技術的第三方面，是要制備得到一種不含Tat疏水區(Tat第31-45位氨基酸)的原核表達量高、構象相對穩定并能誘導產生更強免疫反應的新型HIV-1Tat免疫原。本專利技術通過拼接PCR方法獲得人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)HXB2株天然Tat(參見文獻:0pi S, Peloponese JM Jr, Esquieu D, Campbell G, de Mareui I J, WalburgerA, Solomiac M,Gregoire C,Bouveret E,Yirrell DL,Loret EP.TatHIV-1primaryand tertiary structures critical to immune response againstnon-homologousvariants.J Biol Chem.2002; 277 (39):35915-35919.)分子高疏水區段第 31-45 位氨基酸缺失的Tat Δ (31-45)DNA片段，構建其原核表達質粒，經過轉化大腸桿菌(E.coli)BL21 (DE3),用異丙基-β -D-硫代卩比喃半乳糖苷(isopropyl β -D-l-t本文檔來自技高網...
【技術保護點】
人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技術特征摘要】
1.人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體，其氨基酸序列如SEQID NO:1所示。2.根據權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體在制備HIV免疫原中的應用。3.根據權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體在制備預防和治療性HIV疫苗中的應用。4.根據權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體在制備HIV檢測試劑盒中的應用。5.編碼如權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。6.根據權利要求5所述的編碼人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體的核苷酸序列在制備HIV免疫原中的應用。7.根據權利要求6所述的編碼人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體的核苷酸序列在制備HIV免疫原中的應用，其特征在于，是將該編碼人類免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突變體的核苷酸序列...
【專利技術屬性】
技術研發人員：曹潔，楊界，潘衛，張華群，王錦紅，廖文婷，祁培培，陳秋莉，丁超，何婷，丁瑩瑩，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第二軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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