本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種利用絲狀真菌(Tolypocladium?inflatum)發(fā)酵培養(yǎng)物制備環(huán)孢菌素A衍生物的方法。該方法包括使用助濾劑，經(jīng)過過濾、脫色、吸附、結(jié)晶等步驟，得到環(huán)孢菌素A衍生物的粗提物，再借助聚合物微球?qū)Υ痔嵛镞M(jìn)行層析分離，得到高純度的環(huán)孢菌素A衍生物產(chǎn)品。本發(fā)明專利技術(shù)的優(yōu)點在于采用大孔樹脂提取分離環(huán)孢菌素A衍生物，工藝簡單易行，適宜于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)；并首次將聚合物微球用于該產(chǎn)品的層析分離，可以制備高純度的環(huán)孢菌素A衍生物產(chǎn)品。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于工業(yè)微生物
，涉及藥品原料的制備方法，具體地說具體涉及到一種從發(fā)酵培養(yǎng)物中分離純化環(huán)孢菌素A衍生物的制備方法。
技術(shù)介紹
環(huán)抱菌素A (CyclosporineA, CsA)是一種從絲狀真菌(Tolypocladium inf latum)培養(yǎng)液中分離出的由11個氨基酸組成的環(huán)肽。從20世紀(jì)80年代CsA作為免疫抑制劑用于臨床以來，在器官移植治療中發(fā)揮了重大作用，奠定并推動了器官移植的發(fā)展。目前，全世界已有超過20萬例的患者使用環(huán)孢菌素A作為器官移植時的抗排斥反應(yīng)藥物(陳代杰編。微生物藥物學(xué)[M]。上海:華東理工大學(xué)出版社，1999，140)。此外，環(huán)孢菌素A還具有廣泛的其它生物學(xué)活性如抗真菌、抗寄生蟲、抗HIV、抗炎、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等作用，但是，由于其存在比較嚴(yán)重的肝腎毒性以及溶解性差，治療指數(shù)窄，生物利用度低等缺點影響了它在這些領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。人們開始嘗試對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造合成了一系列化合物，并從中尋找毒副作用低的免疫抑制劑或雖然無免疫抑制活性，但毒性低，具有其它生物學(xué)活性的衍生物(季新燕，溫耀明，陳振偉等。環(huán)孢素的生物學(xué)活性及其衍生物的研究進(jìn)展，國外醫(yī)藥抗生素分冊，2006，27 (3): 116-121)。在4-和/或5-位氨基酸修飾的NM811和其它9種環(huán)孢菌素A衍生物，具有非免疫抑制活性，可用于HIV感染治療和預(yù)防AIDS (EP04840281)。環(huán)孢菌素A衍生物，結(jié)構(gòu)見附圖6，是最近開發(fā)的另一類環(huán)孢菌素，即4位上的羥基衍生物，是用環(huán)孢菌素A為原料經(jīng)過6-7步反應(yīng)合成或用微生物氧化環(huán)孢菌素A而得到的。國際申請專利W00001715報道了在位置4上含有不同于亮氨酸的N-甲基化的或N-乙基化的疏水或中性氨基酸，這些化合物具有高效抑制HIV-1復(fù)制的能力(TetrahedronLett.41，2000，7193-6)和HCV誘導(dǎo)的丙型肝炎抑制作用(CN200480024604 [I].4)，而不具有Csk的免疫抑制活性，其中NIM811和DIB0025是具有該特性的最具代表的化合物。環(huán)孢菌素A衍生物是合成該類非免疫抑制化合物的重要中間體。化學(xué)法合成環(huán)孢菌素A衍生物反應(yīng)步驟長(6-7步化學(xué)反應(yīng))，收率低(10%左右)。微生物氧化環(huán)孢菌素A得到環(huán)孢菌素A衍生物的收率很高，達(dá)到70 %以上，因此，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)環(huán)孢菌素A衍生物的成本優(yōu)勢十分明顯。目前，用微生物發(fā)酵法制備環(huán)孢菌素A衍生物的文獻(xiàn)及專利很少。韓國專利KR2005002764A報道了將環(huán)孢菌素A用DMSO溶解后，用Sebekia benihana進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，得到環(huán)孢菌素A衍生物代謝產(chǎn)物，然后用大孔樹脂AmberliteXAD-16orAmberlite XAD-1180進(jìn)行吸附。由于在生物轉(zhuǎn)化環(huán)孢菌素A的過程中，除了目的產(chǎn)物外，還會有其他的環(huán)孢菌素A衍生物類似物。因此，僅僅用大孔樹脂吸附而不進(jìn)一步純化，此專利方法步驟雖然簡便，但產(chǎn)品含量較低，相關(guān)物質(zhì)不能有效得到控制，得到的環(huán)孢菌素A衍生物純度不高。韓國專利KR2004088593A也報道了該環(huán)孢菌素A衍生物的制備方法，先將轉(zhuǎn)化菌Sebekia benihana用大豆粉等營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng),將環(huán)孢菌素A用DMSO溶解后，加入到Sebekia benihana培養(yǎng)液中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。該專利只涉及發(fā)酵培養(yǎng),提高環(huán)孢菌素A的生物轉(zhuǎn)化率，不涉及環(huán)孢菌素A衍生物的分離純化過程。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于克服上述不足之處，研究設(shè)計一種制備高純度、高收率的環(huán)孢菌素A衍生物的制備工藝。本專利技術(shù)首次采用聚合物微球分離純化發(fā)酵液粗提物，通過梯度解析，有效地去除了發(fā)酵代謝過程產(chǎn)生的雜質(zhì)，得到高含量的環(huán)孢菌素A衍生物精粉，含量大于98.5 %，單雜小于1.0 %，總收率大于70 %，適于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)高純度環(huán)孢菌素A衍生物。下面對本專利技術(shù)進(jìn)行具體描述:本專利技術(shù)的目的是這樣實現(xiàn)的:在環(huán)孢菌素A衍生物發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌均勻，過濾，脫色，吸附、解吸、濃縮、結(jié)晶，得到粗提物；粗提物用極性溶劑溶解后上樣至聚合物微球?qū)游鲋褂盟c極性溶劑的混合液梯度解析，收集環(huán)孢菌素A衍生物洗脫液，經(jīng)濃縮、萃取、結(jié)晶、干燥，得到高含量環(huán)孢菌素A衍生物精粉。本專利技術(shù)所得環(huán)孢菌素A衍生物可供藥品使用，最重要的是作為合成非免疫抑制化合物的重要中間體使用。環(huán)孢菌素A衍生物含量可達(dá)98.5%以上，單雜小于1%，樣品回收率大于70%。 具體地，本專利技術(shù)涉及一種高純度環(huán)孢菌素A衍生物的制備方法，包括下述步驟:I)常溫條件下在環(huán)孢菌素A衍生物發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌50分鐘-1.5小時至助濾劑分散均勻，過濾，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物濾液；2)濾液使用大孔脫色樹脂脫色；3)脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，飽和樹脂用解吸劑解吸，得到解吸液；4)解吸液濃縮、結(jié)晶，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物粗粉；5)將環(huán)孢菌素A衍生物粗粉用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋?)使用極性溶劑與水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集環(huán)孢菌素A衍生物洗脫液；7)洗脫液濃縮、萃取、結(jié)晶，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物精粉。其中，步驟I)中調(diào)節(jié)發(fā)酵液中加入的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，優(yōu)選為珍珠巖，助濾劑用量為發(fā)酵液體積的0.01: 1-0.1: 1(克/升)，優(yōu)選為0.02: 1-0.04: 1(克/升)；攪拌時間為50分鐘-1.5小時。步驟2)中的大孔脫色樹脂為SD-2、LX-700、D290、D315、D301樹脂，優(yōu)選為SD-2或LX-700樹脂。步驟3)中的大孔吸附樹脂為D312、HZ816、XAD-1600、AB-8、HZ801、X-5樹脂，優(yōu)選為D312樹脂及HZ816樹脂，解吸劑為甲醇、丙酮或乙醇的水溶液，優(yōu)選為乙醇的水溶液。步驟4)所述的濃縮、結(jié)晶，要求收集的解吸液在20°C _75°C條件下真空濃縮，優(yōu)選為50-55°C，濃縮后結(jié)晶液濃度控制在100g/L-120g/L，得到環(huán)孢菌素A衍生物粗粉。步驟5)、6)所述的極性溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、乙腈中的一種，各步驟使用的極性溶劑可不相同，步驟6)中梯度洗脫的極性溶劑所占比例可為20-90%，優(yōu)選40-70%。步驟6)中使用的聚合物微球是采用聚苯乙烯、聚丙烯酸酯及其衍生物制備的。步驟7)中所述的濃縮、萃取，要求解吸液濃縮后的體積為解吸液體積的1/8-1/12，濃縮液再加入0.5: 1-3: 1(升/升)的醋酸乙酯、二氯甲烷中的一種萃取，優(yōu)選為醋酸乙酯，萃取劑加入量優(yōu)選為1: 1-2: 1(升/升)。步驟7)所述的結(jié)晶，結(jié)晶析出溶劑可以是的正己烷或石油醚中的一種，優(yōu)選為正己烷，析出溶劑加入量為2: 1-10: I結(jié)晶液體積(升/升)，優(yōu)選為2: 1-10: 1(升/升)，結(jié)晶液過濾后真空干燥，得到白色的環(huán)孢菌素A衍生物純品。本專利技術(shù)所得產(chǎn)品可供藥品或藥物中間體使用，環(huán)孢菌素A衍生物的HPLC含量大于98.5%，樣品提取總收率大于70%。本專利技術(shù)有如下優(yōu)點:1.通過在發(fā)酵液中加入助濾劑，然后進(jìn)行固液分離，可有效去除其中的菌絲體、未用完的培養(yǎng)基、雜蛋白和金屬離子，提高了過濾速度，縮短了工藝周期，并得到澄清的濾液。2.大孔脫色樹脂及吸附樹脂的應(yīng)用，去除了大部分色素和極性大的雜質(zhì)，提高本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種高純度環(huán)孢菌素A衍生物的制備方法，其特征在于該方法包括下述步驟：1)在常溫條件下在環(huán)孢菌素A衍生物發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌50分鐘?1.5小時至助濾劑分散均勻，過濾，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物濾液；2)濾液使用大孔脫色樹脂脫色；3)脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，飽和樹脂用解吸劑解吸，得到解吸液；4)解吸液濃縮、結(jié)晶，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物粗粉；5)將環(huán)孢菌素A衍生物粗粉用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋?)使用極性溶劑與水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集環(huán)孢菌素A衍生物洗脫液；7)洗脫液濃縮、萃取、結(jié)晶，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物精粉。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種高純度環(huán)孢菌素A衍生物的制備方法，其特征在于該方法包括下述步驟: 1)在常溫條件下在環(huán)孢菌素A衍生物發(fā)酵液中加入助濾劑，攪拌50分鐘-1.5小時至助濾劑分散均勻，過濾，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物濾液； 2)濾液使用大孔脫色樹脂脫色； 3)脫色液導(dǎo)入大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附，飽和樹脂用解吸劑解吸，得到解吸液； 4)解吸液濃縮、結(jié)晶，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物粗粉； 5)將環(huán)孢菌素A衍生物粗粉用極性溶劑溶解，注入聚合物微球?qū)游鲋? 6)使用極性溶劑與水的混合液進(jìn)行梯度洗脫，收集環(huán)孢菌素A衍生物洗脫液； 7)洗脫液濃縮、萃取、結(jié)晶，固液分離得到環(huán)孢菌素A衍生物精粉。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，環(huán)孢菌素A衍生物指的是(Y-hydroxylmethylleucine4)_cyclosporin A。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟I)所述的助濾劑為珍珠巖或硅藻土，助濾劑的用量為每升發(fā)酵液加入助濾劑0.01-0.1千克。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)所述大孔脫色樹脂為SD-2、LX-700、D290、D315、·D301 樹脂。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張雪霞，董愛華，任風(fēng)芝，李曉露，李寧，陳書紅，成曉迅，林毅，王海燕，李麗紅，張金娟，林旸，張麗，張艷立，高月麒，張艷哲，蔣沁，段寶玲，
申請(專利權(quán))人：華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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