一種人類免疫缺陷病毒核酸檢測試劑盒制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供一種人類免疫缺陷病毒HIV核酸檢測試劑盒，所述試劑盒中包括至少兩套引物探針，且所述至少兩套引物探針分別來自不同的保守區(qū)域。優(yōu)選的是，所述保守區(qū)域包括HIV基因的相對保守區(qū)：GAG、POL和LTR區(qū)。本發(fā)明專利技術(shù)設(shè)計組合兩個不同區(qū)域的兩套引物探針配制反應(yīng)體系對HIV-1RNA進行聯(lián)合檢測以鑒別陽性反應(yīng)的存在，有效降低了漏檢的幾率，能夠更全面的覆蓋所有亞型（包括HIV-1的M、N、O群的所有亞型），并進一步提高檢測靈敏度和更準(zhǔn)確地定量，其檢測靈敏度可達50IU/ml，定量線性范圍為50~1.0×108IU/ml。本發(fā)明專利技術(shù)另外提供一種HIV核酸檢測試劑盒，所述試劑盒中包括一套引物探針序列，所述引物探針序列選自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2這六套中的任意一套。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于診斷試劑
，具體涉及一種人類免疫缺陷病毒Hiv-1的熒光PCR檢測試劑盒。
技術(shù)介紹
獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiency syndrome,AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus, HIV)感染而引起的疾病，又稱艾滋病。該病患者的免疫功能部份或完全喪失，⑶4+細(xì)胞(cd4和cd8是T淋巴細(xì)胞上的抗原蛋白質(zhì)，其中cd4+稱為輔助性T細(xì)胞)數(shù)目減少，繼而發(fā)生機會性感染、腫瘤等，臨床表現(xiàn)多種多樣。1981年世界報告首例艾滋病病例至今，在短短30年間，艾滋病已肆虐全球，奪去2500多萬人的生命。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署21日發(fā)布年度報告，全球2010年艾滋病病毒(HIV)攜帶者大約3400萬人，比2009年增加70萬。自1985年我國發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病人以來，我國艾滋病感染人數(shù)逐年上升。中國疾控中心性病艾滋病預(yù)防控制中心數(shù)據(jù)顯示，我國累計報告艾滋病病毒感染者 和病人43.4萬人，其中死亡8.8萬人。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署、世界衛(wèi)生組織和衛(wèi)生部聯(lián)合專家組評估，截至2011年底，估計我國存活艾滋病感染者和病人78萬。HIV感染的病毒學(xué)診斷技術(shù)一般包括病毒分尚和病毒成份(如抗原、核酸)的檢測。實驗室檢測包括病毒蛋白抗體檢測、抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、核酸檢測等方法。其中，抗體檢測的初篩試劑主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫熒光試驗(IFA);ELISA用去污劑裂解HIV或感染細(xì)胞液提取物作抗原，IFA用感染細(xì)胞涂片作抗原進行抗體檢測，如果發(fā)現(xiàn)陽性標(biāo)本應(yīng)重復(fù)一次；確認(rèn)試劑通常采用Western blot (WB,蛋白印跡法)，即用聚丙烯酰胺凝膠電泳將HIV蛋白進行分離，再經(jīng)轉(zhuǎn)移電泳將不同蛋白條帶轉(zhuǎn)移于硝酸纖維膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶標(biāo)抗體染色，就能測出針對不同結(jié)構(gòu)蛋白抗體，如抗gpl20、gp41、P24抗體，特異性較高。抗原檢測則用ELISA檢測P24抗原，在HIV感染早期尚未出現(xiàn)抗體時，血中就有該抗原存在；但由于P24量太少，陽性率通常較低；現(xiàn)有用解離免疫復(fù)合物法或濃縮P24抗原來提高敏感性。病毒分離培養(yǎng)的常用方法為共培養(yǎng)法，即用正常人外周血液分離單個核細(xì)胞，加PHA刺激并培養(yǎng)后，加入病人單個核細(xì)胞進行共培養(yǎng)。核酸檢測是用PCR法或基于轉(zhuǎn)錄的系列復(fù)制方法檢測HIV基因，具有快速、高效、敏感和特異等優(yōu)點，目前該法已被應(yīng)用于HIV感染早期診斷及艾滋病的研究中。艾滋病病毒進入人體后，機體需要經(jīng)過一段時間才會產(chǎn)生抗體，在此期間血液抗體檢測呈陰性，抗原抗體通常是在感染后3-6周后才能被檢測出來。而近幾年發(fā)展起來的艾滋病核酸檢測技術(shù)是檢查病毒本身的技術(shù)，感染七天之后就能檢測出來，殘余風(fēng)險度大大下降，能夠提前預(yù)防，比傳統(tǒng)的試紙檢測更精確，時間上更為提前。PCR方法雖然靈敏并能在早期對病毒進行檢測，但是因其步驟繁瑣且容易造成污染，從而使其在使用上收到一定限制。實時熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)的(終點檢測)PCR技術(shù)相比，實時定量監(jiān)測方法不僅實現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和精確度更強、自動化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點。HIV的基因結(jié)構(gòu)與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同，為RNA雙分子，其單鏈RNA分子由9749個核苷酸組成，有3組共9個基因。第一組為逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的基因，即gag、pol和erw基因，及側(cè)翼的長末端重復(fù)順序(LTR)等；其中前述三個基因為病毒的結(jié)構(gòu)基因，編碼病毒蛋白，而基因組兩端的LTRs，不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達，無種屬特異性。第二組為調(diào)節(jié)基因表達的基因，即tat、rev和nef基因，可以增強或抑制其它基因的表達。第三組為特有基因，負(fù)調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放，即vif、vpu和vpr。根據(jù)HIV基因結(jié)構(gòu)、免疫學(xué)和流行病學(xué)的特征，HIV被分為HIV-1和HIV-2兩大類，HIV-1的感染力較強，在世界各地廣為流行，而HIV-2主要集中在非洲西部、歐洲、美國，南美的一些地區(qū)也偶有報道。在進化樹上，HIV-1主要分為三群(group)，分別用Μ、O和N表示，M的含義是“major”，是全球HIV-1流行的主要形式，超過90%以上的感染屬于HIV-1M群。O是“outlier”的意思，O群主要集中在中非，占整個HIV-1感染者的比例不足5%，N代表“non Mnon B”的意思，全球感染僅在局部地區(qū)有報道。HIV-1M群內(nèi)按照基因序列的差異，又可分為不同的亞型(subtype)，目前已經(jīng)明確HIV-1 M群分為9個亞型，按照發(fā)現(xiàn)的先后次序用英文字母A D、F H、J和K來表示，E和I亞型已證實為不同亞型重組的產(chǎn)物，所以取消這兩種亞型。流行重組型(circulating recombinant form, CRF)是指由不同亞型之間基因相互重組形成的新的具有感染性的重組病毒形式。造成CRF出現(xiàn)的原因除了基因自身突變形成HIV-1基因的變異之外，不同病毒感染同一個細(xì)胞后造成DNA序列重組是主要原因。病毒重組后形成新的CRF，重組可發(fā)生在HIV不同或相同亞型間，由于重組后的病毒基因組中含有大段的來自不同親本的基因，所以更容易改變重組毒株的遺傳特性和生物學(xué)表型，但大部分重組株可能產(chǎn)生缺損毒株，不能造成傳播或成為獨特重組型(unique re-comb inantform, URF)病毒，將逐漸在人群中消失。只有那些因重組而獲得生物學(xué)表型優(yōu)勢的重組株才能在人群中廣泛傳播，進而成為CRF。最常出現(xiàn)重組的位置是gag區(qū)和env區(qū)，目前至少有34個不同的流行重組型(CRF)。 HIV有十分高的遺傳變異率，它是一個多態(tài)性病毒，從不同的AIDS患者體內(nèi)分離出的病毒結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出一定的差異，事實上，獨立分離到的HIV-1和2彼此都不相同，這是由于病毒傳播過程中突變，缺失或插入引起的，高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gpl20的五個區(qū)段，gag和pol基因較少變異，因此，只有選擇病毒基因組中高度保守區(qū)域作為目的基因加以擴增，才能有效地檢測所有HIV的變異性。目前普通的熒光定量PCR檢測技術(shù)，僅采用一套引物探針較難擴增出所有的基因亞型，它僅能檢測幾種主要的型別，比如A、B、C、B/C、A/E，其后果是產(chǎn)生漏檢或各亞型間的定量不準(zhǔn)確。目前國內(nèi)已有的HIV熒光定量PCR檢測試劑不多，僅有3-4種，且檢測靈敏度低，約在1000IU/ml左右；對于低值(小于1.00E+03IU/ml)的樣本無法檢出或者無法準(zhǔn)確定量，不能滿足臨床檢測的需求。國外性能優(yōu)異的同類試劑是Roche (羅氏)公司的“RocheAmpliPrep-Cobas TaqMan HIV_lTest”診斷系統(tǒng),使用Iml的樣本量,應(yīng)用磁珠法原理采用全自動化的儀器進行RNA提取，然后自動加樣進行RNA的熒光PCR擴增，實現(xiàn)臨床樣本中HIV-RNA的定量檢測。該診斷系統(tǒng)具有自動化程度高、操作簡便、檢測靈敏度高(大于40copies/ml)等優(yōu)點；但是樣本需求量(Iml)太大，而且全自動化操作的試劑成本和耗材成本太高，很難在臨床廣泛開展。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)提供一種人類免疫缺陷病毒HIV核本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】
一種人類免疫缺陷病毒核酸檢測試劑盒，所述試劑盒中包括至少兩套引物探針，且所述至少兩套引物探針分別來自不同的保守區(qū)域。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種人類免疫缺陷病毒核酸檢測試劑盒，所述試劑盒中包括至少兩套引物探針，且所述至少兩套引物探針分別來自不同的保守區(qū)域。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述保守區(qū)域包括HIV基因的相對保守區(qū):GAG基因、POL基因和LTR區(qū)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述LTR中的引物探針序列為LTRl或LTR2，所述GAG中的引物探針為GAGl或GAG2，所述POL中的引物探針序列為POLl或P0L2;且其序列分別如下:LTRl: 上游引物 LTR-Fl:5’ -AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3’， 下游引物 LTR-Rl:5’ -AGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTAC-3’，探針 LTR-Pl:5’ -AGTCACACAACAGACGGGCACACACT-3’ ；LTR2: 上游引物 LTR-F2:5’ -CCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’， 下游引物 LTR-R2:5’ -GGCGCCACTGCTAGAGATT-3’，探針 LTR-P2:5’ -ACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACC-3’ ；GAGl: 上游引物 GAG-Fl:5’ -AGCCCAGAAGTAATACCCATGTT-3’， 下游引物 GAG-Rl:5’ -CATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’，探針 GAG-Pl:5’ -CATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3’ ；GAG2: 上游引物 GAG-F2:5’ -GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGA-3’， 下游引物 GAG-R2:5’ -GGTTCTCTCATCTGGCCTGGT-3’， 探針 GAG-P2:5’ -TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’ ；POLl: 上游引物 POL-Fl:5’ -GACATAATAGCAACAGACATACAAACTA-3’， 下游引物 POL-Rl:5’ -ACTGCCCCTTCACCTTTCC-3’，探針 POL-Pl:5’ -TCTCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3’ ；P0L2: 上游引物 P0L-F2:5’ -CTGGAAAGGTGAAGGGGCAGT-3’， 下游引物 P0L-R2:5’ -ATCCTCATCCTGTCTACCTGCCA-3’，探針 P0L-P2:5’ -CAATCATCACCTGCCATCTGTTTTCCATA-3’。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中使用的引物探針序列為LTRl和POLl。5.根據(jù)權(quán)利要求廣4中任意一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括RNA提取溶液I IV，其中， RNA提取溶液1:由十二烷基硫酸鈉0.2 1.0% (質(zhì)量/體積)、曲拉通1.(Γ4.0% (體積/體積)，異硫氰酸胍0.2l.0mol/L和10(Γ400 μ g/ml的磁珠組成； RNA提取溶液I1:包括4-羥乙基哌嗪乙磺酸10(T300mmol/L、氯化鈉10(T300mmol...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴立忠，熊曉燕，鄧中平，
申請(專利權(quán))人：湖南圣湘生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：