檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法技術

本發明專利技術涉及檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法，屬于食品檢測技術領域。本發明專利技術所解決的技術問題是提供了一種檢測限更低的檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法。本發明專利技術檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法包括如下步驟：a、分別將待檢測肉制品提取液和系列濃度的恩拉霉素標準液加入到預包被恩拉霉素抗原的微孔中；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗體，混勻后孵育；c、于各微孔中加入辣根過氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分別于各微孔中加入底物溶液，顯色；e、分別于各微孔中加入終止液終止反應，用酶標儀讀取各孔OD450值；f、對照恩拉霉素標準液所得的曲線回歸方程，計算出待檢測肉制品中的恩拉霉素含量。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及，屬于食品檢測

技術介紹
恩拉霉素(Enramycin)，又名恩來霉素、恩霉素、安來霉素、持久霉素，是由土壤中分離出來的放線菌Streptomyces fungicidious N0.B5477發酵產生的一種多肽類抗生素。該藥于1966年由日本武田藥品工業株式會社研發，1974年在日本正式注冊，其后在許多國家被注冊和廣泛使用。該藥對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、檸檬色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎球菌、枯草桿菌、炭疽桿菌、破傷風梭菌、肉毒梭菌、產氣莢膜梭菌等革蘭氏陽性菌有很強的殺菌活性，可通過抑制腸道中有害細菌的生長和繁殖來改變腸道內的菌群平衡，增加飼料中營養物質的吸收和利用。長期使用該藥，不易產生耐藥性，與其他抗生素之間不產生明顯交叉耐藥，同時有化學性能穩定，無致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，殘留少，適口性好等優勢，因此被世界上許多國家推薦作為抗生素促生長劑，常作為飼料添加劑用于促進動物增重和提高飼料利用效率。1988年我國農業部批準進口該藥，現在已有恩拉霉素預混料銷售，并且呈現良好的市場發展前景。隨著全球貿易自由化進程的加快，以及“二噁英”、藥物殘留等有毒有害物質造成的重大動物源性食品污染事件的頻發，世界各國都構筑起各具特色的動物產品質量安全管理體系，從法律法規體系、檢驗檢疫監管體系、標準體系、認證體系等方面來保證動物源性產品的質量安全。由于對動物產品藥殘檢測研究起步較晚，我國的藥殘檢測標準和檢測水平落后于發達國家。發達國家憑借在科技、管理、環保等方面的優勢，從技術法規、標準、合格評定程序等方面對我國動物產品出口不斷設置新的“綠色貿易壁壘”門檻，致使在我國國內合格的動物產品在出口后被進口國檢出抗生素、農藥、獸藥殘超標而被退回或銷毀的事件屢見不鮮，造成的直接和間接經濟損失在百億美元以上。因此，提高我國動物產品藥殘的檢測水平勢在必行。獸藥殘留檢測是復雜混合物中痕量組分的分析技術，抗生素的殘留量一般都在微克到納克級，經典的化學分析法無法檢測或定量不夠準確，因此要求殘留抗生素檢測法必須達到靈敏、快速、高效。抗生素殘留檢測法總體可以歸為3大類:微生物檢測法、理化檢測法和免疫分析技術。微生物檢測法是應用較廣泛的方法，其測定原理是根據抗生素對微生物的生理機能、代謝的抑制作用，來定性或定量確定樣品中抗生素微生物藥物殘留，其衍生出的紙片法(PD)對氯霉素最低檢出量0.01mg/L ;氯化三苯基四氮唑法(tripheye tetrazoliumchloride, TTC法)對青霉素的最低檢出量為0.004IU/mL ;管碟法對青霉素的敏感度為0.01U/mL ;戴爾沃檢測法(SP)其靈敏度為:青霉素3ng/mL，鏈霉素300ng/mL，慶大霉素400ng/mL。隨著研究的深入，還出現了拭子法、牛的抗生素和磺胺實驗法(CAST)、快速抗生素篩選法(FAST)等更為靈敏、準確、簡便、快速的微生物檢測方法。微生物檢測方法能檢測出接近最高殘留限量濃度水平的樣品，能夠進行大批量、快速、靈敏的測定，且可以非實驗室環境下進行。微生物檢測法具有不需要特殊設備、操作簡單、易推廣、靈敏度高、適用于大批量樣品的同時檢測等優點，缺點是操作繁瑣，檢測周期長，環境要求高，顯色狀態判斷通過肉眼判斷，其結果的主觀性強。理化檢測法是利用抗生素分子中的基團所具有的特殊反應或性質來測定其含量，如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、質譜法、聯用技術等，能進行定性、定量和藥物鑒定，敏感性較高，但有的檢測程序較復雜，檢測成本高，儀器設備要求高，操作規范嚴格。免疫分析技術是目前最理想的殘留篩選性分析方法之一。在目前藥物殘留分析中主要分為兩大類:一為相對獨立的分析方法，即免疫測定法(Immunoassays, IAs),如RIA、ELESA、固相免疫傳感器等；二是將免疫分析技術與常規理化分析技術聯用，如免疫親合色譜(IAC)，它可使獸藥殘留分析將免疫技術的高選擇性和理化技術的快速分離和靈敏性融為一體，避免了 IA直接測定樣本信息量太少、假陽性或理化分析技術選擇性低等不足，分析過程簡化。IAC-HPLC或IAC-GC是常見的聯用方式，如氯霉素、阿維菌素和伊維菌素等殘留分析。未來獸藥殘留分析技術中的免疫分析技術將向試劑標準化、使用更靈敏和抗干擾性強的標記物和理化分析技術聯用方向發展。 免疫分析技術與常規的理化分析技術相比，最突出的優點是操作簡單，速度快、分析成本低。如ELISA法，免疫測定方法取樣量小，前處理簡單，容量大，儀器化程度低，檢測與GC/MS或GC/ECD相似，可達到ng/g-pg/g級，分析效率則為HPLC或GC的幾十倍以上。目前大部分抗生素已經建立了免疫測定法，如磺胺二甲嘧啶、氯霉素、沙拉沙星、鏈霉素、四環素、莫能菌素等。ELISA試劑盒是目前使用最廣泛、快速、靈敏的檢測抗生素殘留的方法，但是各類抗生素試劑盒多為國外生產，使得國內檢測花費非常大，如德國拜耳公司生產的抗生素檢測試劑盒，一個96次檢測試劑盒要花3800元，每個樣品的檢測要花3(Γ50元，因此很有必要研制和開發出國產的試劑盒，以降低成本，提高經濟效益。日本已建立畜、水產性食品中恩拉霉素殘留檢測方法，我國建立了恩拉霉素預混料和飼料級的檢測，袁而森(1999)在此基礎上探索過對肉制品殘留檢測，檢測限量為0.3ppm，其檢測方法都是微生物檢測法。Horie (1985)利用高效液相色譜分析豬、雞肌肉恩拉霉素殘留，檢測限量為0.2ppm。恩拉霉素的ELISA檢測方法和試劑盒都未曾見報道。由于目前世界各國的食品安全衛生控制指標限量逐步降低，食源性危害關鍵檢測技術趨向高科技化、系列化(多殘留檢測)、速測化、器具便攜化，建立新的高敏感度、便攜化的、低成本的恩拉霉素藥殘檢測方法以適應現在的動物產品檢驗檢疫要求是非常有必要的。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種檢測限更低的。本專利技術包括如下步驟:a、分別將待檢測肉制品提取液和系列濃度的恩拉霉素標準液加入到預包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制備得到:取待檢測肉制品剪碎，勻衆，加濃度為50%v/v的甲醇-水溶液，勻漿，用濃HCl調整pH值3.5 4.0,混勻，8000 12000rpm離心8 12min，取上清液，用NaOH調節pH值至8.0,8000 12000離心8 12min，取上清液，即得待檢測肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申請號為CN201010556432.2的方法制備得到；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗體，混勻后孵育；C、于各微孔中加入辣根過氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分別于各微孔中加入底物溶液，顯色；e、分別于各微孔中加入終止液終止反應，用酶標儀讀取各孔0D450值；f、對照恩拉霉素標準液所得的曲線回歸方程，計算出待檢測肉制品中的恩拉霉素含量。其中，采用a步驟中的方法制備肉制品提取液可以提高待檢測肉制品中的恩拉霉素的溶解性和回收率，同時還提高了提取液中的恩拉霉素的穩定性。其中，本專利技術，所述的恩拉霉素抗原可以采用申請號為CN201010556432.2，專利技術名稱為“一種恩拉霉素完全抗原的合成方法”的專利申請公開的方法制備得到。 其中，為了節本文檔來自技高網...

【技術保護點】
檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法，其特征在于包括如下步驟：a、分別將待檢測肉制品提取液和系列濃度的恩拉霉素標準液加入到預包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制備得到：取待檢測肉制品剪碎，勻漿，加濃度為50%v/v的甲醇?水溶液，勻漿，用濃HCl調整pH值3.5～4.0，混勻，8000～12000rpm離心8～12min，取上清液，用NaOH調節pH值至8.0，8000～12000離心8～12min，取上清液，即得待檢測肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申請號為CN201010556432.2的方法制備得到；b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗體，混勻后孵育；c、于各微孔中加入辣根過氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育；d、分別于各微孔中加入底物溶液，顯色；e、分別于各微孔中加入終止液終止反應，用酶標儀讀取各孔OD450值；f、對照恩拉霉素標準液所得的曲線回歸方程，計算出待檢測肉制品中的恩拉霉素含量。

【技術特征摘要】
1.測肉制品中恩拉霉素殘留的方法，其特征在于包括如下步驟: a、分別將待檢測肉制品提取液和系列濃度的恩拉霉素標準液加入到預包被恩拉霉素抗原的微孔中；其中，所述的肉制品提取液采用下述方法制備得到:取待檢測肉制品剪碎，勻漿，加濃度為50%v/v的甲醇-水溶液，勻漿，用濃HCl調整pH值3.5 4.0，混勻，8000 12000rpm離心8 12min，取上清液，用NaOH調節pH值至8.0,8000 12000離心8 12min，取上清液，即得待檢測肉制品提取液；所述的恩拉霉素抗原采用申請號為CN201010556432.2的方法制備得到； b、然后于各微孔中加入抗恩拉霉素抗體，混勻后孵育； C、于各微孔中加入辣根過氧化物酶HRP—羊抗兔IgG，混合后孵育； d、分別于各微孔中加入底物溶液，顯色； e、分別于各微孔中加入終止液終止反應，用酶標儀讀取各孔OD45tl值； f、對照恩拉霉素標準液所得的曲線回歸方程，計算出待檢測肉制品中的恩拉霉素含量。2.根據權利要求1所述的檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法，其特征在于:b步驟中加入抗恩拉霉素抗體為含有抗恩拉霉素抗體的血清。3.根據權利要求2所述的檢測肉制品中恩拉霉素殘留的方法，其特征在于:a步驟中所述的預包被恩拉霉素抗原的包被濃度為2.30ug/mL, b步驟中加入的含有抗恩拉霉素抗體的血清的稀釋度為1:10000。4.根據權利要求1所述的檢測肉...

【專利技術屬性】
技術研發人員：嚴玉寶，余華，葉健強，廖黨金，胡娟，謝晶，崔鵬博，周岷江，
申請(專利權)人：中華人民共和國四川出入境檢驗檢疫局，四川省畜牧科學研究院，
類型：發明
國別省市：