一種檢測肉及肉制品中牛源性成分的方法技術

本發明專利技術涉及一種檢測肉及肉制品中牛源性成分的方法。該方法包括一對牛特異性引物，上游引物為：5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；下游引物為：5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；及與其配合使用的探針5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’，以及包含所述引物和探針的試劑盒。本發明專利技術方法最大程度地降低了定量誤差，具有較高的準確性和抗干擾能力，能夠準確、便捷的檢出牛肉及其制品中牛源性分占總肉成分的百分比含量。本發明專利技術提供了單重和雙重兩種PCR模式，分別適用于不同的需求。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及食品檢驗和生物
，具體地說，涉及。
技術介紹
食品〃摻雜使假〃 一直是消費者關注的焦點問題之一，有些不法企業和商家為了降低成本，在肉制品加工過程中以豬肉冒充牛羊肉，或以其它低價肉替代高價肉而未在標簽上注明。這不僅嚴重侵害了消費者利益，而且如果清真食品中摻有豬肉成分還會涉及到民族和宗教等問題，造成惡劣的社會影響。此外，流行病學研究證明飼料中的動物源性成分是造成“瘋牛病”等神經系統疾病傳播的主要因素。目前，用于肉種成分鑒定的技術大多建立在對蛋白質結構與DNA序列特異性分析 的基本上，包括酶聯免疫(ELISA)、聚合酶鏈式反應(PCR)、電泳、色譜、生物傳感分析等技術。其中，Taqman實時熒光PCR (Taqman PCR)法在靈敏度、準確性和重復性等重要性能參數上無可比擬的優勢，成為該領域的主流技術，是作為仲裁方法和司法鑒定的理想技術類型，是現行國家和行業標準中指定的方法之一。然而，現有的研究大多集中在對飼料中豬、牛、羊等動物源性成分的定性檢測上，而用于食品摻假鑒別，特別是涉及有關核酸成分定量檢測技術的研究較為滯后。單純的定性檢測已不能滿足需求，如在肉、奶等食品“摻雜使假”案件的處理中，如何判定摻假成分是添加還是污染所致，如何確定摻假嚴重程度都需要有可靠的定量技術作為依托。生物樣品的復雜性，如動物種別、年齡、性別、器官、肌肉類型差別等，導致DNA提取總量和擴增靶序列模板總量差異，給標準樣品的選定和制備造成困難。因此急需系統誤差小、可信度高的食品摻假行為判定方法的出現。
技術實現思路
本專利技術目的是提供一種牛特異性引物和探針，用于檢測肉及肉制品中牛源性成分。本專利技術再一目的是提供含有上述引物的試劑盒。本專利技術又一目的是提供一種檢測試樣中牛源性成分含量的方法，用于量化判定待測牛肉產品中牛肉純度，是否存在摻假行為和摻假情況的嚴重程度。本專利技術所述牛特異性引物是根據牛線粒體DNA中NADH脫氫酶4亞基基因上牛特異性堿基序列設計而成，其核苷酸序列為上游引物為5’-AATATAAITTGGGTTAACTCCACAGC-3’ ；下游引物為5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’ ；并設計了與上述引物配合使用的探針，其核苷酸序列為5’ -F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’;其中，F 為熒光報告基團，M 為熒光淬滅基團。優選地，F為 FAM ;M 為 TAMRA。為實現本專利技術目的，本專利技術還提供一種脊椎動物通用引物和探針，其是根據脊椎動物線粒體DNA (16s rDNA)上的保守序列設計，上游引物為5’-TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’ ；下游引物為5，-AGATAGAAACCGACCTG GAT-3’；探針為 5’-FAM-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’(用于單重 PCR)或5’ -HEX-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-TAMRA-3’(用于雙重 PCR)。本專利技術進一步提供一種利用上述引物和探針通過單重PCR測定樣品中牛肉成分占總肉成百分比含量的方法，具體包括以下步驟I)制備待測樣品勻漿，提取DNA。2)提取純牛肉DNA，稀釋至至少5個濃度梯度作為標準品，制作標準曲線，濃度跨度范圍可根據實際需求調整，提取過程與I)同步，或事先制備好。3)單重PCR，采用上述牛特異性引物和探針，通用引物和探針(F為FAM)對步驟I)和2)獲得的DNA模板，在I個PCR板上的不同反應管同時進行PCR擴增，按照表I進行加樣，PCR過程在I個通道收集熒光信號；然后按照公式I計算出待測樣品中牛源性成分的百分含量。表I單重PCR 96孔板加樣方案權利要求1.一種檢測肉及肉制品中牛源性成分的牛特異性引物，其特征在于，上游引物為5’ -AATATAAITTGGGTTAACTCCACAGC-3’ ；下游引物為5’ -GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’。2.含有權利要求1所述引物的試劑盒。3.一種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，其核苷酸序列為5’ -F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’;其中，F 為熒光報告基團，M 為熒光淬滅基團。4.根據權利要求3所述的探針，其特征在于，所述熒光報告基團為FAM，所述熒光淬滅基團為TAMRA。5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括脊椎動物通用引物和探針，上游引物為5’ -TACGACCTCGATGTTGGATCA-3’ ；下游引物為5’ -AGATAGAAACCGACCTGGAT-3’ ；所述探針為5’ -F-CCGGTCTGAACTCAGATCACGTAGGA-M-3’，其中，F為熒光報告基團，M為熒光淬滅基團；優選F為FAM或HEX ；M為TAMRA。6.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、 PCR反應緩沖液、純牛肉DNA標準品中的一種或幾種。7.—種檢測肉及肉制品中牛源性成分的方法，其特征在于，1)待測樣品勻漿，提取DNA;2)提取純牛肉DNA，進行濃度梯度稀釋，制作標準品；3)分別以步驟I)和步驟2)中提取的DNA為模板，用權利要求1所述的引物、權利要求3所述的探針和權利要求5所述的通用引物和探針進行PCR擴增，以純牛肉標準品的劑量-效應曲線為標準曲線，計算待測樣品中牛源性成分的百分含量。8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR為單重PCR，其中10μ I反應體系包含9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應條件為95°C變性 10-15秒，58-62 °C退火+延伸45-60秒，35個循環。10.權利要求1所述引物、權利要求2或5-6任一項所述試劑盒在檢測牛肉及其制品摻假中的應用。全文摘要本專利技術涉及。該方法包括一對牛特異性引物，上游引物為5’-AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC-3’；下游引物為5’-GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG-3’；及與其配合使用的探針5’-F-CACAGCCTTCTAATTAGCTTTACAAGCCTCC-M-3’，以及包含所述引物和探針的試劑盒。本專利技術方法最大程度地降低了定量誤差，具有較高的準確性和抗干擾能力，能夠準確、便捷的檢出牛肉及其制品中牛源性分占總肉成分的百分比含量。本專利技術提供了單重和雙重兩種PCR模式，分別適用于不同的需求。文檔編號C12Q1/68GK102994637SQ201210487438公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月26日 優先權日2012年11月26日專利技術者李家鵬, 周彤, 田寒友, 楊君娜, 鄒浩, 喬曉玲, 陳文華, 曲超 申請人:中國肉類食品綜合研究中心本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種檢測肉及肉制品中牛源性成分的牛特異性引物，其特征在于，上游引物為：5’?AATATAATTTGGGTTAACTCCACAGC?3’；下游引物為：5’?GCCATATGGTTAAAATTAGTAGTGGAGTG?3’。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：李家鵬，周彤，田寒友，楊君娜，鄒浩，喬曉玲，陳文華，曲超，
申請(專利權)人：中國肉類食品綜合研究中心，
類型：發明
國別省市：