本發明專利技術公開了一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測方法和試劑盒，所述方法包括以下步驟：1）第一抗體或受體的固定；2）特異性捕捉樣品中的待檢物；3）連接第二抗體或受體，其中，所述第二抗體或受體標記有第一核苷酸序列；4）雜交：將與所述第一核苷酸序列具有互補的第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列雜交；5）轉移：采用酶切或置換核酸的方法，將所述第二核苷酸序列分離并轉移到PCR管中；6）檢測：定量PCR檢測所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，該含量反應了所述待檢物的含量。所述試劑盒包含所述檢測方法所涉及的主要成分。本發明專利技術具有操作簡單，檢測準確性高的有益效果。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物樣品中待檢物的檢測技術，尤其涉及一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測方法和試劑盒。
技術介紹
Y干擾素是一種具有多種功能的免疫活性蛋白，具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調節和控制細胞凋亡等作用。干擾素及相關細胞因子的作用一直是生物醫學研究的熱點。然而干擾素體內生物學作用很大但含量非常低，正常人血液內每毫升只有幾個皮克，甚至更低。因此，研究專利技術一種高效、便捷、準確、成本低的監測手段顯得非常重要。目前，常用的檢測Y 干擾素的方法有儀器分析法和免疫檢測法。儀器分析法主要包括高效液相色譜法(HPLC)和質譜，靈敏度很高，但它需要昂貴的儀器設備，耗材要求高及樣本預處理，在專業人員的操作下才能進行。這類儀器分析法已經不能達到現代檢測對快速、方便、成本低的要求。免疫分析方法通常是指通過抗體與抗原的特異性特點用抗體(或抗原)來檢測抗原(或抗體)的檢測方法。這種特異性相互識別不限于抗原與抗體，受體與配體，酶與底物， 凝集素與多糖也適用。免疫檢測的經典方法是酶聯免疫吸附法(ELISA)。傳統ELISA通過抗原非特異地結合到固相支持物上，實現了被檢抗原從溶液中轉移。洗滌去除多余的(未結合的)抗原后，封閉板孔。然而，在固相支持物上，固定的抗原與抗體連接形成一個免疫復合物，洗滌去除未結合的抗體，酶可以直接連接到抗體上，再通過酶聯檢測一抗。或者添加隨后與板連接的二抗。連接到固相支持物的酶活性與固定在固相支持上的抗原呈一定的比例關系，例如，可以通過一種顯色基質和酶的作用，計算支持物上抗原的含量。該方法簡單，經濟，專一性好，而且已廣泛采用自動化操作。但其檢測靈敏度低，對干擾素和細胞因子的常規檢出效果很差。而聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction縮略詞為PCR)技術有很高的檢測靈敏度，為了增強ELISA的靈敏度，免疫PCR運用而生。免疫PCR(Immun0-PCR，IPCR) 最早是由Sano等人提出，與間接ELISA類似，不同的是免疫PCR使用一段DNA鏈作為檢測分子替代了 ELISA反應中的酶。文獻顯示Sano等人通過BSA與抗BSA抗體反應證實了免疫組化的效果，其通過蛋白A-親和素連接系統將生物素標記的質粒DNA標記到一抗上，隨后PCR擴增與抗原連接的DNA分子，擴增30個循環，EB染色，接著凝膠電泳分析。此方法與ELISA比，免疫PCR顯著提高了檢測靈敏度。這靈敏度可以通過純化系統來驗證，但由于其存在過程繁瑣，步驟多的特點，很難在實際的醫學研究中運用。采用‘夾心’式的方法執行免疫PCR，即包被抗體在固相支持物上如微孔板、磁珠顆粒，捕獲樣品中的抗原，緊接著添加檢測抗體，檢測抗體上標記有報告分子如放射性同位素、熒光素、DNA和酶，這產生 了一個特殊的免疫復合物(抗體-抗原-抗體復合物)固定在固相支持物表面，反復洗滌固相支持物表面，去除未結合的抗原-抗體。在洗滌步驟中， 保持免疫復合物的完整性很重要，以致使信號強度最大化，由此最大限度的降低背景。在洗滌后，通過檢測報告分子來定量這個固定的‘檢測’抗體。報告分子的量能顯示出抗原的存在量。當這個檢測系統是足夠靈敏時，系統的最低靈敏度通常由游離‘檢測’抗體非特異結合所產生背景的程度決定的。在診斷和生物科學領域，需要一個強有力的檢測方法去分析一些低水平(低濃度) 存在的物質，且隨著人類基因組測序和分析的完成，這種需求變得越來越迫切。這些蛋白應該被分析和定性，但是使用當前的檢測技術不能量化這些蛋白。免疫PCR做為一種高靈敏度的檢測方法，為物質高靈敏檢測提供了一個保證，但目前為止，傳統ELISA存在靈敏度低，傳統免疫PCR操作復雜且背景偏高，導致只能檢測一部分物質，因此，很有必要開發新的技術來解決這些問題。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是，提供一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測方法和試劑盒，提高檢測靈敏度，降低操作要求。本專利技術的技術問題通過以下技術手段予以解決一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟1)第一抗體或受體的固定在支持物上連接生物樣品中待檢物的第一抗體或受體；2)特異性捕捉生物樣品使生物樣品中的待檢物通過一個連接位點與所述第一抗體或受體結合；3)連接第二抗體或受體將待檢物的第二抗體或受體連接到所述待檢物的另一個連接位點上，其中，所述第二抗體或受體標記有第一核苷酸序列；4)雜交將與所述第一核苷酸序列具有互補的第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列雜交； 5)轉移采用置換或酶切核酸的方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列并轉移到PCR管中；6)檢測定量PCR檢測所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，該含量反應了所述生物樣品中待檢物的含量。優選地所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列5 ; -aagctcgatatcagagga aggaggagggac-3 '；所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列5' -tccttcctctgatatcga gettggcgtaatcagggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccg gaagcataaagtgtaaagcctgaagtgcctaatgagtg-3 } 0所述步驟5)中采用置換方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列包括采用與所述第一核苷酸序列互補的置換核酸分子與所述第二核苷酸序列進行置換，所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所不序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸,序列表SEQ ID NO. 5所示序列為5 ' -gtccctcctccttc ctctgatatcgagctt-3 ',序列表 SEQ ID NO. 6 所不序列為5 ' -tccttcctctgatatcgagctt -3丨;或者所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列中均包含酶切位點，所述步驟5)中采用酶切方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列采用限制性內切酶進行洗脫。所述待檢物為人Y干擾素。—種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測試劑盒，其特征在于包括支持物；待檢物的第一抗體或受體；待檢物的第二抗體或受體，該第二抗體或受體標記有第一核苷酸序列；單鏈DNA片段，該單鏈DNA片段具有與所述第一核苷酸具有互補的第二核苷酸序列； 以及酶切試劑或與所述第一核苷酸序列互補的置換核酸分子；所述酶切試劑包括酶解反應液和酶解反應終止液優選地所述第一核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列；所述第二核苷酸序列具有序列表SEQ ID NO. 2所示的序列。所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 5所示序列的DNA序列或所述置換核酸分子為具有序列表SEQ ID NO. 6所示序列的肽核酸。與現有技術相比，本專利技術在生物樣品中待檢物的免疫PCR檢測過程中采用DNA雜交、復合物轉移技術，通過將雜交的單鏈DNA片段釋放出來，而非特異性結合的單鏈DNA片段依舊留著原有支持物上，顯著降低了實驗背景，大幅提高了人Y干擾素檢測的靈敏度， 傳統ELISA方法最低檢測限量一般在5pg/mL左右，線性范圍l(Tl本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種生物樣品中待檢物的夾心免疫PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：1）第一抗體或受體的固定：在支持物上連接生物樣品中待檢物的第一抗體或受體；2）特異性捕捉生物樣品：使生物樣品中的待檢物通過一個連接位點與所述第一抗體或受體結合；3）連接第二抗體或受體：將待檢物的第二抗體或受體連接到所述待檢物的另一個連接位點上，其中，所述第二抗體或受體標記有第一核苷酸序列；4）雜交：將與所述第一核苷酸序列具有互補的第二核苷酸序列與所述第一核苷酸序列雜交；5）轉移：采用置換或酶切核酸的方法從所述支持物上洗脫所述第二核苷酸序列并轉移到PCR管中；6）檢測：定量PCR檢測所述PCR管中第二核苷酸序列的含量，該含量反應了所述生物樣品中待檢物的含量。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳慶軍，周翔，陽云，
申請(專利權)人：深圳市達科為生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。