用于表達、傳遞及純化目標多肽的重組載體分子制造技術

本發明專利技術是用于表達、傳遞及純化目標多肽的重組載體分子。提供具有來自熱穩定酶的氨基酸序列的重組載體分子和用于表達、回收和傳遞在活體外或活體內不同體系(細菌、酵母、DNA、細胞培養物，諸如哺乳動物、植物、昆蟲細胞培養物、原生質體和全植株)中產生的外源序列(肽和多肽)的方法。還使用來自地衣多糖酶B(Lic?B)的序列制備了重組載體分子且將其用作載體蛋白的一部分來表達、回收和傳遞所討論的各種目標多肽。（*該技術在2024年保護過期，可自由使用*）

【技術實現步驟摘要】

本專利技術是針對蛋白質表達、純化及分子生物學領域。特定而言，本專利技術是針對載體蛋白表達，其中使用熱穩定酶的成 熟多肽作為載體分子以供產生、回收及傳遞目標多肽。載體分子可用于在包括植物及哺乳動物細胞培養物的不同表達體系及宿主中產生外源序列。
技術介紹
疫苗是防止并甚至消除傳染性疾病最有效的方法。盡管有大量基于全病原體的有效疫苗，但是研制基于部分病原體(亞單位疫苗)的更安全有效而且更經濟的疫苗是很重要的。過去二十年中已經研究出若干疫苗抗原表達(細菌、酵母、哺乳動物細胞培養物及植物)及傳遞(DNA、活病毒載體、純化蛋白、植物病毒粒子)的方法。所有這些方法對研發和檢驗新近研制出的候選疫苗具有顯著影響。然而，需要改進表達和傳遞體系以產生更有效而更安全并具有更小副作用的疫苗。未來疫苗所希望的某些特點為:(a)高效(刺激免疫體系的兩個臂)，(b)具有已知和受控基因組成，(C)具有體系時效性，(d)適于表達小型肽及大型多肽兩者，(e)適于在不同體系(細菌、酵母、哺乳動物細胞培養物、活病毒載體、DNA載體、轉基因植物和瞬時表達載體)中表達，及(f)能夠形成諸如凝聚體(aggregate)或類病毒粒子(virus like particle)之易于回收且具有免疫原性的結構。因此，需要用于以工程學改變、研制和傳遞有效亞單位疫苗的新穎載體分子。此等載體分子應提供以下優點和靈活性:在不同體系中表達商業上充足量的目標多肽，從源材料中經濟地回收目標多肽，容納不同尺寸(4個氨基酸及更多)的多肽，容納串連重復的目標多肽，提供增強的免疫功能，用作高通量篩選工具，及用作疫苗免疫原和疾病標記物的傳遞工具。
技術實現思路
在本專利技術中發現了一種新穎重組蛋白。其將作為一種用于表達和回收有用目標多肽的載體分子，這些目標多肽是用作對抗傳染性疾病或甚至癌癥的治療性或預防性藥劑。本文發現的載體分子可容納不同大小(4個氨基酸至IOOkD的蛋白或更大)的多肽(目標多肽)而且可表達于不同體系中。目標多肽可為疫苗抗原。在一般性方面，本專利技術提供一種重組載體分子，所述重組載體分子具有缺少一個或一個以上氨基酸節段的熱穩定酶的被修飾成熟多肽，或熱穩定酶的實質上完整的成熟多肽，其適于在該成熟多肽的每個N端和C端以及視情況在環區(loop region)中與異源多肽融合。被修飾成熟多肽和實質上完整的成熟多肽保留了它們的熱穩定性及/或酶活性。修飾成熟多肽是因為它缺少環區或具有被中斷的環區，或在環區中具有至少一個并非自然存在于野生型熱穩定酶中的限制位點(restriction site)。在一個優選實施例中，本文發現的載體分子是基于來自熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)的地衣多糖酶(Iichinase B) (IicB)基因(登記號:X63355, [g1:40697])。本專利技術者發現此熱穩定細菌酶可用作產生目標多肽用載體分子。其具有暴露于遠離活性域的表面上的環狀結構。本專利技術者已經發現此環狀結構可用于插入目標多肽。所述目標多肽可表達為N端或C端融合或內部融合及/或表達為環狀結構插入物。表達被修飾的蛋白質并且表征其任何參數，例如熱穩定性、最佳活性的PH與溫度條件。工程蛋白(engineeredprotein)保持了其最佳活性的pH與溫度條件。工程蛋白也沒有改變其在65°C下的熱穩定性。因此，本專利技術揭示源自熱穩定酶的重組分子，其用作各種異源目標多肽(例如疫苗、激素、抗凝劑(anticoaulant)、免疫球蛋白、干擾素、白細胞介素(interleukin)、造血生長因子等)的載體。在特定實施例中揭示Rec LicB和LicKM。載體蛋白(即連接一個或一個以上異源目標多肽的被修飾或工程學改變的rec LicB或LicKM)為融合蛋白且其可表達于原核或真核體系中。特別是已經發現這些載體分子可容納小型多肽到高達IOOkD或更多的大型多肽，可容納相同多肽的串連重復；可表達于不同體系中，包括細菌、酵母、桿狀病毒、哺乳動物細胞培養物、植物、DNA及病毒載體；由于其熱穩定性或形成凝聚體的能力可提供回收目標產物的經濟優點；可用作篩選目標多肽的高通量體系；抗原、疾病標記物或其它治療性多肽。本專利技術也揭示一種以融合蛋白形式表達肽的方法，所述方法是通過將熱穩定酶的重組成熟多肽用作異源多肽的載體并使用本專利技術所描述的肽表達方法。附圖說明圖LA:以工程學改變重組LicKM載體分子的圖示。I為環狀結構。A表示環狀結構的上游區域。C表示環狀結構的下游區域。為生成LicKM，在環區分裂且如圖所示組裝編碼Lic B的基因。以工程學改變過程中產生單一克隆位點。該圖B部分展示工程分子LicKM的核酸序列(SEQ ID NO:1)。使用特異性引物由PCR進行分裂。PCR產生2個亞克隆(圖1A)，命名為A (159個核苷酸，364至522)和C (486個核苷酸，523至1009)。在最后的克隆中，沿片段C的下游克隆片段A，保留原始氨基酸組成。圖1C展示來自野生型LicB的Rec LicB結構。Rec LicB由不含纖維素分解劑(cel Iulosome)結合域的成熟蛋白組成。目標序列可與N端和C端融合,也可使用BamHI和BglII限制位點融合至環狀結構中。圖1D展示工程分子Rec LicB的核酸序列(SEQ ID NO:2) 圖1E展示由LicKM核酸(SEQ ID NO:1)編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。圖1F 展示由 Rec LicB (SEQ ID NO:2)編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO:4) 圖1G展示LicKM載體分子變異體的核酸序列(SEQ ID N0:5)。它同樣具有在5’端產生的KpnI限制位點和在3’端產生的XhoI限制位點以及在環區的BamHI/Bgl位點。圖1H展示由LicKM載體分子變異體(SEQ ID NO:5)編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:6)。圖2.將GFP克隆至rec Lic B的環狀結構中以獲得重組Lie B-GFP的圖示。GFP的編碼區域經PCR擴增并克隆至LicB的開放閱讀框(open reading frame)中。用2個步驟由PCR完成克隆。使用圖1的圖例中所示引物產生2個亞克隆A和C。接著PCR擴增該等編碼GFP的序列(在PCR過程中在5’端和3’端分別結合BamHI和BglII限制位點)。接著，使用引入的BamHI和BglII位點將3個片段連接成A-GFP-C以得到LicB-GFP。GFP的引物為:正鏈:5，gcaggga tcc atg gtg age aag ggc gag3，(SEQ ID NO:7)反鏈:5，gcagaga tct ctt gta cag ctc gtc cat3，(SEQ ID NO:8) 圖3.在0.1%地衣多糖(Iichenan)作為基質存在下檢測細菌和酵母提取物中地衣多糖酶(Iichenase)活性的酶譜。在12%PAGE中分離蛋白。向凝膠中載入由E.coli菌株XL-1blue [C對照，LicB (野生型)，LicKM (工程載體分子)和重組LicB-GFP (E)]和釀酒酵母(Saccharromyces cerevisiae)菌株 YPH 857 (LicB-GFP (Y)中提本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種重組多肽，其包含經修飾的地衣多糖酶B(lichenase?B)多肽，所述地衣多糖酶B多肽包含與SEQ?ID?NO：3的氨基酸14?231位或SEQ?ID?NO：6的氨基酸8?226位具有至少90％序列相似性的氨基酸序列。

【技術特征摘要】
2003.05.22 US 60/472,4951.一種重組多肽,其包含經修飾的地衣多糖酶B(lichenase B)多肽，所述地衣多糖酶B多肽包含與SEQ ID NO:3的氨基酸14-231位或SEQ ID NO:6的氨基酸8-226位具有至少90%序列相似性的氨基酸序列。2.如權利要求1所述的重組多肽，其中所述經修飾的地衣多糖酶B多肽由SEQID NO:1或5編碼。3.如權利要求1所述的重組多肽，其中所述經修飾的地衣多糖酶B多肽包含與SEQIDNO:3的氨基酸14-231位或SEQ ID NO:6的氨基酸8-226位具有至少95%序列相似性的氨基酸序列。4.如權利要求1所述的重組多肽,其中所述經修飾的地衣多糖酶B多肽包含由SEQIDNO:3或SEQ ID NO:6所示的序列。5.如權利要求1所述的重組多肽，其中所述經修飾的地衣多糖酶B多肽具有SEQIDNO:3的氨基酸14-231位氨基酸序列或SEQ ID NO:6的氨基酸8-226位氨基酸序列。6.如權利要求1所述的重組多肽，其還包含一個與所述經修飾的地衣多糖酶B多肽融合的異源多肽序列以生成融合蛋白。7.如權利要求6所述的重組多肽，其中所述經修飾的地衣多糖酶B多肽與兩個或更多個含抗原決定部位的異源多肽片段融合。8.如權利要求6所述的重組多肽，其中所述異源多肽序列包含來自于生長因子、細胞分裂素、配體、受體、抑止子、抗原、抗原決定部位、T細胞抗原決定部位、B細胞抗原決定部位、抗體、水解酶、綠色熒光蛋白、干擾素、白細胞介素、病原體相關蛋白或毒素的一個序列。9.如權利要求6所述的重組多肽，其中所述異源多肽序列包含一個疫苗抗原。10.如權利要求1所述的重組多肽，其還包含一用于分離或純化或其兩者的標簽。11.如權利要求10所述的重組多肽，其中所述標簽是His6。12.如權利要求6所述的重組多肽，其還包含一酶切割位點。13.如權利要求12所述的重組多肽，其中所述切割位點是位于所述異源多肽和所述經修飾的地衣多糖酶B多肽之間。14.如權利要求1所述的重組多肽，其還包含一個標簽和一個切割位點，其中所述切割位點位置與所述標簽相鄰。15.如權利要求1所述的重組多肽，其還包含一聯結子。16.—種編碼如權利要求1-15中任一權利要求所述的重組多肽的核酸。17.—種包含如權利要求16所述的核酸的表達載體。18.如權利要求17所述的表達載體，其中所述載體是植物病毒載體。19.一種包含如權利要求17所述的表達載體的宿主細胞。20....

【專利技術屬性】
技術研發人員：維達季·尤西波夫，瓦季姆·梅特，康斯坦丁·穆西丘克，
申請(專利權)人：美國弗勞恩霍夫股份有限公司，
類型：發明
國別省市：