純化活性多肽或免疫偶聯(lián)物的方法技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)提供了使用陰離子交換色譜法，通過(guò)純化含有一種活性多肽或免疫偶聯(lián)物以及它的一種酸性變體（例如一種脫氨酶變體）的溶液而分離該活性多肽或免疫偶聯(lián)物的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】專(zhuān)利技術(shù)背景專(zhuān)利
本專(zhuān)利技術(shù)提供了用于從包含一種多肽或免疫偶聯(lián)物以及它的一種酸性變體的溶液中對(duì)該活性多肽或免疫偶聯(lián)物進(jìn)行純化的方法，其中該酸性變體是所述多肽或免疫偶聯(lián)物的一個(gè)脫酰胺化種類(lèi)。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了包含此類(lèi)經(jīng)純化的多肽或免疫偶聯(lián)物的配制品。
技術(shù)介紹
大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)純化是生物制藥行業(yè)的一個(gè)因素。治療性蛋白質(zhì)典型地是使用原核或真核細(xì)胞系產(chǎn)生的，這些細(xì)胞系經(jīng)過(guò)工程化處理以表達(dá)來(lái)自一種重組質(zhì)粒的感興趣的蛋白質(zhì)，該質(zhì)粒包含編碼該蛋白質(zhì)的基因。將所希望的蛋白質(zhì)從被送至細(xì)胞的組分和細(xì)胞副產(chǎn)物的混合物中以達(dá)到足以用作治療劑(例如足以用作一種人類(lèi)治療物)的純度進(jìn)行分離由于多個(gè)原因?qū)ι镏破分圃焐烫岢隽藝?yán)峻的挑戰(zhàn)。基于蛋白質(zhì)的藥物產(chǎn)物的制造商必須遵守嚴(yán)格的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，包括極為嚴(yán)格的純度要求。為了確保安全性，監(jiān)管機(jī)構(gòu)(例如美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA))要求基于蛋白質(zhì)的藥物產(chǎn)品基本上不含雜質(zhì)，包括與產(chǎn)品相關(guān)的污染物(例如聚集體)、該重組蛋白的片段和變體以及與過(guò)程相關(guān)的污染物(例如宿主細(xì)胞蛋白、培養(yǎng)基組分、病毒、DNA以及外毒素)。盡管在生物制藥行業(yè)可以獲得并廣泛使用不同的蛋白純化方案，但他們典型地包括一個(gè)親和純化步驟，例如對(duì)于抗體而言進(jìn)行蛋白A純化，以便達(dá)到藥學(xué)可接受的純度。形成一個(gè)可適用于某一特定生物分子或不同生物分子的純化方案(該方案是成規(guī)模的、可控的、并且在策略上采用了特定樹(shù)脂或樹(shù)脂組合的用途)應(yīng)當(dāng)允許它在整個(gè)藥物形成過(guò)程中的非常早期的階段整合至產(chǎn)品形成過(guò)程中。設(shè)計(jì)一種純化方案的方法能夠?qū)⒅圃爝^(guò)程的昂貴費(fèi)用變化最小化，否則這可能隨后在藥物發(fā)展中是必需的或在批準(zhǔn)之后情況更壞。隨著該過(guò)程成規(guī)模并且達(dá)到GMP生產(chǎn)條件，額外的固有復(fù)雜問(wèn)題即產(chǎn)生，包括與樹(shù)脂包裝和緩沖液制備有關(guān)的復(fù)雜問(wèn)題。制造過(guò)程及其能力可通過(guò)以下方式改進(jìn)簡(jiǎn)化純化方案、取消過(guò)程步驟并且將產(chǎn)出和生產(chǎn)率最大化，同時(shí)維持正在純化的分子的完整性和純度。因此，令人希望的并且有利的是以一個(gè)簡(jiǎn)單并且有效的過(guò)程起始，該過(guò)程能產(chǎn)生一種具有高質(zhì)量和高安全性的藥物物質(zhì)。與藥物產(chǎn)品的純化相關(guān)的一個(gè)復(fù)雜問(wèn)題是在整個(gè)純化過(guò)程中維持效力。很多因素能造成效力的降低或抑制，包括在發(fā)展過(guò)程中藥物產(chǎn)品的修飾。這種修飾能在該過(guò)程的各個(gè)階段發(fā)生，例如當(dāng)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞中表達(dá)時(shí)、或當(dāng)已經(jīng)從細(xì)胞中分離的蛋白質(zhì)經(jīng)受各種條件或緩沖液時(shí)。本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種用于從包含多肽或偶聯(lián)物的經(jīng)修飾的變體的溶液純化該活性多肽或免疫偶聯(lián)物的方法，其中這種經(jīng)修飾的變體的存在導(dǎo)致了最終藥物產(chǎn)品效力的抑制。專(zhuān)利技術(shù)概述本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種用于從包含多肽以及一種酸性變體(例如一種脫酰胺化的變體)的溶液中純化感興趣的多肽的方法。具體而言，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種用于純化活性免疫偶聯(lián)物的方法，其中該免疫偶聯(lián)物在一個(gè)或多個(gè)殘基上脫酰胺化，并且其中這種脫酰胺化作用導(dǎo)致所述免疫偶聯(lián)物效力的抑制，該方法包括:(a)將該免疫偶聯(lián)物與一種陰離子交換AIEX色譜基質(zhì)相接觸；并且(b)用一種高鹽緩沖液將該結(jié)合的免疫偶聯(lián)物從該AIEX色譜基質(zhì)洗脫，從而將該活性偶聯(lián)物與該脫酰胺化的變體分離。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種用于從包含多肽以及該多肽的一種酸性變體的溶液中產(chǎn)生經(jīng)純化的多肽的方法，其中該多肽的酸性變體導(dǎo)致了該多肽效力的抑制，該方法包括:(a)將該多肽與一種陰離子交換(AIEX)色譜基質(zhì)相接觸，并且(b)用一種高鹽緩沖液將該結(jié)合的多肽從該AIEX色譜基質(zhì)洗脫，從而將所述多肽與該酸性變體分開(kāi)并且產(chǎn)生一種經(jīng)純化的多肽。本專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)一步提供了一種從含該肽以及該多肽的一種酸性變體的溶液中產(chǎn)生經(jīng)純化的多肽或免疫偶聯(lián)物的方法，該方法包括:(a)在一種表達(dá)該多肽或免疫偶聯(lián)物的細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生該多肽或免疫偶聯(lián)物；(b)將包含多肽或免疫偶聯(lián)物的包涵體從這些細(xì)菌細(xì)胞分離；(C)將從這些包涵體分離的多肽或免疫偶聯(lián)物再折疊；(d)將包含該多肽或免疫偶聯(lián)物的組合物與一種AIEX色譜基質(zhì)相接觸；并且(b)用一種高鹽緩沖液將該結(jié)合的多肽或免疫偶聯(lián)物從該AIEX色譜基質(zhì)洗脫，從而將該多肽或免疫偶聯(lián)物從該溶液中純化。在某些實(shí)施方案中，該酸性變體是一種脫酰胺化的變體。在其他實(shí)施方案中，在純化過(guò)程中該酸性或脫酰胺化變體的約75%至約99%之間被去除，尤其是約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。本專(zhuān)利技術(shù)的AIEX基質(zhì)包含季胺或叔胺的離子交換基團(tuán)，一個(gè)季氨(Q)基團(tuán)，在某些實(shí)施方案中，該AIEX基質(zhì)是Q瓊脂糖凝膠。本專(zhuān)利技術(shù)的多肽或免疫偶聯(lián)物用線性或階梯式鹽梯度洗脫。在某些實(shí)施方案中，該線性鹽梯度是從約Tris/HCl、pH8.0中的150mM NaCl至Tris/HCl、pH8.0中的約300mMNaCl，從 Tris/HCl、ρΗ8.0 中的約 175mMNaCl 至 Tris/HCl、ρΗ8.0 中的約 275mM NaCl，或從Tris/HCl、pH8.0 中的約 192mM NaCl 至 Tris/HCl、pH8.0 中的約 245mM NaCl。在一個(gè)實(shí)施方案中，本專(zhuān)利技術(shù)的多肽或免疫偶聯(lián)物包括一種抗體或它的抗原結(jié)合片段，其中該該抗體或抗原結(jié)合片段包括一個(gè)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、單鏈Fv或scFv、雙硫化物連接的Fv、V NAR結(jié)合域、IgNar、內(nèi)抗體(intrabody)、IgG CH2、迷你抗體、F (ab’)3、四體抗體(tetrabody)、三體抗體(triabody)、雙體抗體(diabody)、單一結(jié)構(gòu)域抗體、DVD_Ig、Fcab、mAb2、a(scFv) 2、或scFv_Fc。在一些實(shí)施方案中，該抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合一種細(xì)胞表面受體，例如該細(xì)胞表面受體是CD22。在其他實(shí)施方案中，該抗體或它的抗原結(jié)合片段包括一個(gè)VH和VL序列，其中該VH序列選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:SEQ ID N0:6至11，并且該VL序列選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:SEQ ID N0:2以及12至15。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該多肽或免疫偶聯(lián)物包括一種毒素，其中該毒素選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素以及它們的亞單位，連同肉毒桿菌毒素A至F或變體、或它們的衍生物。在一些實(shí)施方案中，該綠膿桿菌外毒素或它的變體具有一個(gè)氨基酸序列，該序列選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:SEQ ID NO: 16至22。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，該免疫偶聯(lián)物是包括SEQ ID NO:1的VH-PE38亞單位以及SEQ ID NO:2的VL亞單位的CAT-8015免疫毒素。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種組合物，該組合物包括一種具有小于約25%與約1%之間的脫酰胺化種類(lèi)的經(jīng)純化的免疫偶聯(lián)物，其中所述免疫偶聯(lián)物通過(guò)以上所說(shuō)明的任意一種方法純化。該組合物可以存在小于約25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%的該脫酰胺化種類(lèi)。在某些實(shí)施方案中，該組合物是一種藥物組合物，它包括一種經(jīng)純化的多肽或免疫偶聯(lián)物以及一種藥學(xué)上可接受的載體。本專(zhuān)利技術(shù)還提供一種配制品，該配制品包括25mM磷酸鈉、4%蔗糖、8%甘氨酸、O. 02%聚山梨酸酯80 (PS80)、pH7. 4中的lmg/mL CAT-8015。在其他實(shí)施方案中，該配制品被冷凍干燥。本專(zhuān)利技術(shù)還提供了一種本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國(guó)外來(lái)華專(zhuān)利技術(shù)】2010.07.30 US 61/369,1481.一種純化活性免疫偶聯(lián)物的方法，其中所述免疫偶聯(lián)物在一個(gè)或多個(gè)殘基上被脫酰胺化，并且其中所述脫酰胺化作用導(dǎo)致了所述免疫偶聯(lián)物效力的抑制，該方法包括:(a)將該免疫偶聯(lián)物與一種陰離子交換AIEX色譜基質(zhì)相接觸；并且(b)用一種高鹽緩沖液將該結(jié)合的免疫偶聯(lián)物從該AIEX色譜基質(zhì)洗脫，從而將該活性免疫偶聯(lián)物與該脫酰胺化的變體分離。2.一種用于從包含多肽以及該多肽的酸性變體的溶液產(chǎn)生經(jīng)純化的多肽的方法，其中該多肽的所述酸性變體導(dǎo)致了所述多肽效力的抑制，該方法包括:(a)將該多肽與一種陰離子交換(AIEX)色譜基質(zhì)相接觸，并且(b)用一種高鹽緩沖液該所結(jié)合的多肽從該AIEX色譜基質(zhì)洗脫，從而將所述多肽與該酸性變體分離并且產(chǎn)生一種經(jīng)純化的多肽。3.一種用于從包含多肽以及該多肽的酸性變體的溶液中產(chǎn)生經(jīng)純化的多肽或免疫偶聯(lián)物的方法，該方 法包括:(a)在一種表達(dá)多肽或免疫偶聯(lián)物的細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生該多肽或免疫偶聯(lián)物；(b)將包·含該多肽或免疫偶聯(lián)物的包涵體從這些細(xì)菌細(xì)胞分離；(c)將從這些包涵體分離的多肽或免疫偶聯(lián)物再折疊；(d)將包含該多肽或免疫偶聯(lián)物的組合物與一種AIEX色譜基質(zhì)相接觸；并且(b)用一種高鹽緩沖液將該結(jié)合的多肽或免疫偶聯(lián)物從該AIEX色譜基質(zhì)洗脫，從而將該多肽或免疫偶聯(lián)物從該溶液純化。·3.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中該酸性變體是一種脫酰胺化的變體。4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中該AIEX基質(zhì)包含季胺以及叔銨的離子交換基團(tuán)。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中該AIEX基質(zhì)包含一種季氨(Q)基團(tuán)。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該AIEX基質(zhì)是Q瓊脂糖凝膠。7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中該多肽用一種線性或階梯式的鹽梯度洗脫。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中該多肽用一種線性鹽梯度洗脫。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中該線性鹽梯度是從約Tris/HCl、pH8.0中的150mMNaCl 至約 Tris/HCl、pH8.0 中的 300mM NaCl。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該線性鹽梯度是從約Tris/HCl、pH8.0中的175mMNaCl 至約 Tris/HCl、pH8.0 中的 275mM NaCl。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中該線性鹽梯度是從約Tris/HCl、pH8.0中的192mMNaCl 至約 Tris/HCl、pH8.0 中的 245mM NaCl。12.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中該酸性或脫酰胺化變體的約75%至約99%被去除。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該酸性或脫酰胺化變體的約80%被去除。14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該酸性或脫酰胺化變體的約85%被去除。15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該酸性或脫酰胺化變體的約90%被去除。16.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該酸性或脫酰胺化變體的約95%被去除。17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中該酸性或脫酰胺化變體的約96%、97%、98%或99%被去除。18.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中該多肽或免疫偶聯(lián)物包括一種抗體或其抗原結(jié)合片段。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包括一個(gè)Fab、Fab’、F (ab') 2、Fd、單鏈Fv或scFv、雙硫化物連接的Fv、V_NAR結(jié)構(gòu)域、IgNar、內(nèi)抗體、IgG Δ CH2、迷你抗體、F{ah' ) 3、四體抗體、三體抗體、雙體抗體、單一結(jié)構(gòu)域抗體、DVD-1g、Fcab、mAb2、a(scFv)2、或 scFv-Fc。20.如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中該抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合了一種細(xì)胞表面受體。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中該細(xì)胞表面受體是CD22。22.如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中該多肽或免疫偶聯(lián)物包括一種毒素。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中該毒素選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:綠膿桿菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素以及它們的亞單位，連同肉毒桿菌毒素A至F或變體、或它們的衍生物。24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中該毒素是一種綠膿桿菌外毒素、或它的變...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：T·林克，W·K·王，A·夏，H·薩瑟斯，A·亨德，C·湯普森，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：米迪繆尼有限公司，
類(lèi)型：
國(guó)別省市：